一种鉴定藏菖蒲和石菖蒲的特异引物对及其方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药材种质的品质鉴定技术领域，具体涉及一种分别鉴定藏菖蒲、石 菖蒲的特异引物对及其方法。
【背景技术】
[0002] 藏菖蒲、石菖蒲均为《中国药典》2010版的收录品种，藏菖蒲为天南星科植物藏菖 蒲Acorus calamus L.的干燥根莖，石菖蒲为天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott的干燥根茎。藏族习用药材。藏菖蒲和石菖蒲药材在我国均应用广泛，是药食同 源的重要物种，首载于《神农本草经》并沿用至今。在藏区，藏菖蒲的使用和历史都有很 大的价值，其被列为一级濒危藏药药材，药材资源缺乏。有温胃，消炎止痛的功效，用于补 胃阳，治疗消化不良，食物积滞，白喉，炭疽等症。而石菖蒲作为民间常用药和风俗载体以 及其在治疗阿尔茨海默病、、记忆障碍和中风等脑疾病的突出疗效也被大量使用。但是由 于藏菖蒲的活性成分α-细辛醚和β-细辛醚对人类的"三致"（致癌、致畸、致突变）毒 性，美国FDA(Food and Drug Administration)明令禁止食用藏菖蒲及其提取物。历史 上藏菖蒲和石菖蒲的使用并没有很明确的分隔开来，且因地域广泛造成习用名过多，导致 名称混乱。有北美菖蒲A.americanus以及同属物种藏菖蒲Acorus calamus L·、石菖蒲 A. tatarinowii Schott、金钱蒲 A. gramineus Soland.、茴香菖蒲 A. macrospadiceus、金边 菖蒲 A. tatarinowii Schott var. flavo-marginatus Κ· Μ· Liu 等品种和名称，其中茴香菖 蒲、金边菖蒲均为石菖蒲的变种，金钱蒲在《中国植物志》英文版中与石菖蒲并为一种。现 藏菖蒲和石菖蒲相互混用，在药材市场上有"藏菖蒲"、"水菖蒲"、"石菖蒲"和"菖蒲"等多 种叫法，存在同物异名和同名异物的现象。因此，寻找一种简单、高效且可靠的分别鉴定藏 菖蒲和石菖蒲的方法显得尤为重要。
【发明内容】
[0003] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种鉴定藏菖蒲和石菖蒲的特异引物对及 其方法。
[0004] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0005] 所述鉴定藏菖蒲和石菖蒲的共用特异性引物对包括引物Pl和引物Ρ2,所述 引物Pl的序列为5' -CGGATGCGGATGTTGGC-3'（SEQ ID NO. 1)，所述引物Ρ2的序列为 5'-TGGGCTCTTCCCGTTTCG-3'（SEQ ID NO. 2)。
[0006] 所述鉴定藏菖蒲和石菖蒲的方法包括如下步骤：
[0007] (1)按常规方法提取待测药材的DNA ;用权利要求1所述的引物对扩增待测药材的 DNA，得到PCR扩增产物。
[0008] (2)藏菖蒲鉴别：向PCR扩增产物中加入限制性内切酶BsrF I (cfrlOI，BsrFI与 cfrlOI互为同工酶，两者酶切位点一致）进行酶切，限制性内切酶BsrF I和其同工酶的酶 切位点为5' 一ITCCGGY…3' ；将酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，若在100- 200bp出现 两个片段（约130bp和193bp)，则供试品为藏菖蒲，若不出现上述两个片段，则供试品不为 藏菖蒲；
[0009] 石菖蒲鉴别：向PCR扩增产物中加入限制性内切酶BsaH I(HinlI、HgiD I、HgiG I、 Acy I 或 Bbi II，BsaH I 与 Hinll、HgiD I、HgiG I、Acy I、Bbi II 互为同工酶，其酶切位 点一致）进行酶切，限制性内切酶BsaH I和其同工酶的酶切位点为5'一GITCGYC··· 3' ；将 酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，若在100- 250bp出现两个片段（约114bp和209bp)， 则供试品为石菖蒲，若不出现上述两个片段，则供试品不为石菖蒲。
[0010] 步骤⑵所述扩增体系及条件如下：
[0011] 聚合酶链式反应以25 μ L为参考，各种物品的用量分别为：
[0012] I C)x PCR 缓冲液（Mg:- plus ) 2.7 LiL, dNTPs (2.5mM) 1单， 引物 Pl (ΙΟμΜ) 0.5uL, 引物 Ρ2(10μΜ) 0.5 μL, TaqDNA 聚合酶(2.5U4iL) 0.5[iL DNA 投板 1·0μΙ_. 去离子水 补齐至25pL，
[0013] PCR反应条件：反应在PCR仪上进行，反应条件为：94°C预变性5min，94°C变性 30s，62°C退火 30s，72°C延伸 45s，35 个循环后，72°C延伸 lOmin。
[0014] 下面对本发明设计原理等作进一步说明：
[0015] 本发明首先从药材中提取总DNA，利用一对引物，对藏菖蒲和石菖蒲样本进行分别 扩增，扩增DNA片段经纯化后，对该片段进行DNA序列测定，建立各样品的DNA序列数据库， 在比较数据库DNA序列的基础上，得到相应样本的序列特征位点。
[0016] 藏菖蒲部分：藏菖蒲的特征DNA碱基序列为：5' -CCGCAACGGGCCGGTGGCGGTC-3'（S EQ ID NO. 3)，针对藏菖蒲与其他菖蒲DNA序列的差异选择合适的DNA限制性内切酶切位 点，通过分析聚合酶链式反应产物的限制性酶切图谱差异，达到快速、准确鉴别藏菖蒲的目 的。对需要鉴定的藏菖蒲样品，提取其DNA，在给定的PCR条件下，用一对引物（PU P2)，供 试品能够扩增出一段DNA片段；用限制性内切酶BsrF I(CfrlOI)对供试品的PCR扩增产物 进行酶切后（限制性内切酶BsrF I(CfrlOI)的酶切位点为：
[0017] (5'…R~CCGGY…3'），通过琼脂糖凝胶电泳检测，藏菖蒲会在100 - 200bp出现两 个片段（约130bp和193bp)，而其他的菖蒲不会出现上述两片段。当供试样品经用本法进 行PCR扩增，并对PCR产物进行限制性内切酶酶切后，经琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段的大 小，便可以准确地鉴定藏菖蒲药材。
[0018] 石菖蒲部分：通过对石菖蒲酶切位点分析（即SNP-RFLP，分析位点发生突变后是 否会导致酶切位点的出现或丢失），发现石菖蒲与藏菖蒲在序列276的位点存在一个G/C 的SNP位点，其中石菖蒲及金钱蒲、金边菖蒲、茴香菖蒲为G，藏菖蒲为C，此位点位于BsaH 1邱1111、取10 1、取16 1、厶。71、81^11)限制性内切酶识别序列（5、"61?16￥〇"3'）上，使 得石菖蒲可被切开，而藏菖蒲无法切开，故可以区分石菖蒲和藏菖蒲，如图2。因引物（Pl， P2)可以满足在该范围内没有其他的酶切位点，故共用引物（P1，P2)。通过琼脂糖凝胶电泳 检测，石菖蒲会在100- 250bp出现两个片段（约114bp和209bp)，而藏菖蒲不会出现上述 两片段。当供试样品经用本法进行PCR扩增，并对PCR产物进行限制性内切酶酶切后，经琼 脂糖凝胶电泳观察DNA片段的大小，便可以准确地鉴定石菖蒲药材。
[0019] 关于本发明特异引物对设计的说明：
[0020] 一、藏菖蒲、石菖蒲等菖蒲属内各品种的DNA条形码ITS2序列经在NCBI进行 Blast相似度比较，具有很高的相似度，均为95%以上，差别极小，难以设计合适的特异性 引物将三者相互区别。再者，单一品种的ITS2序列存在碱基的多态性，导致所设计引物的 扩增效率很低甚至无法扩增。此特异性PCR鉴别研究前后过程长达2年，前期一共设计了 多对引物仍未能采用将藏菖蒲、石菖蒲等鉴别。
[0021] 二、现改变研究策略，首先寻找藏菖蒲、石菖蒲等的差异酶切位点，然后在其上下 游设计引物，即可很好的将其有效鉴别。现将主要研究过程进行具体解析：
[0022] 1、从 GenBank 查找正品藏菖蒲（登录号：DQ008848、DQ008850、DQ008853)及石 菖蒲（登录号：DQ008844、DQ008845)，金钱蒲（登录号：DQ008846)，茴香菖蒲（登录号： DQ008842)等伪品的ITS2序列（见图1)，用MEGA5. 0软件进行序列比较，寻找差异片段， 并使用Primer Premier 5. 0进行酶切位点分析（分析位点发生突变后是否会导致酶切位 点的出现或丢失）。结果在第353至360碱基之间，藏菖蒲存在一段序列GGGCCGGT(SEQ ID NO. 6)，其包含限制性内切酶BsrF I(CfrlOI)识别位点（5'."ITCCGGY…3'），使得藏菖 蒲可被BsrF I(cfrlOI)切开，而藏菖蒲的混伪品缺失该序列，则不能被BsrF I(cfrlOI) 酶切断，如图1所示。进一步分析发现，在ITS2的其它区域也不存在BsrF I(CfrlOI)的 识别位点，故可以选择BsrF I(CfrlOI)识别序列的上下游进行引物设计，以建立藏菖蒲的 PCR-RFLP鉴别方法。使用Primer Premier 5. 0进行酶切位点分析（分析位点发生突变后 是否会导致酶切位点的出现或丢失）。结果发现石菖蒲与藏菖蒲在序列276的位点存在一 个G/C的SNP位点，其中石菖蒲及金钱蒲、金边菖蒲、茴香菖蒲为G，藏菖蒲为C，此位点位于 BsaH I(HinlI、HgiD I、HgiG I、Acy I、