引物可以在菌量较少的情况下检测到病原菌的存在，实验证明，当待测样品浓 度达IOpg时即可检出，表明上述方法具有较高的灵敏性。并且，二者检测灵敏度相同，均为 10 5 μ g/ μ L，即序列1和序列2组成的引物对葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)基因 组DNA的检测灵敏度与序列3和序列4组成的引物对小新壳梭孢（Neofusicoccum parvum) 基因组DNA的检测灵敏度相同，均为10 5 μ g/ μ L。这组引物可以在一个双重PCR反应中也 可以在此浓度（IO5 μ g/μ L)下分别检测到葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)和小 新壳梭孢（Neofusicoccum parvum)的存在，这表明该组引物可以快速、准确、灵敏的确定 葡萄苗木以及田间葡萄病样中的葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭孢 (Neofusicoccum parvum)，为苗木带菌检测和针对性防治这2种病原菌引起的葡萄溃疡病 提供依据。
[0018] 同时，由于本发明可以减少对葡萄溃疡病病原菌小新壳梭孢（Neofusicoccum parvum)和葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)的鉴定时间，从而尽早的在带菌苗木 和发病早期的病组织中检测到病原菌的存在，达到早期针对性防病的目的。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明的引物B. d-F/B. d-R特异性检测的结果，图中，泳道M为分子 量Marker (DL2000plus DNA Marker)，泳道1-3分别为分离自不同地区的小新壳梭 抱(Neofusicoccum parvum)菌株，4-5 :葡萄溃疡病菌 Lasiodiplodia theobromae ； 6-8 ;葡萄溃疡病菌葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea) ;9_10 :葡萄溃疡病菌 Diplodia seriata;ll:葡萄糖轴褐枯病菌Alternaria viticola;12:葡萄枝枯病菌 Neopestalotiopsis sp. ; 13 :葡萄炭疽病菌 Colletotrichum viniferum ;14 :葡萄灰霉 病菌Botrytis cinerea;15:葡萄白腐病菌Coniella diplodiella;16:葡萄蔓枯病菌 Diaporthe eres : 17是以ddH20为模板的PCR扩增结果。
[0020] 图2为本发明的引物N. P-F/N. P-R特异性检测的结果，图中，泳道M为分子 量Marker (DL2000plus DNA Marker)，泳道1-3分别为分离自不同地区的小新壳梭 抱(Neofusicoccum parvum)菌株，4-5 :葡萄溃疡病菌 Lasiodiplodia theobromae ； 6-8 ;葡萄溃疡病菌葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea) ;9_10 :葡萄溃疡病菌 Diplodia seriata;ll:葡萄糖轴褐枯病菌Alternaria viticola;12:葡萄枝枯病菌 Neopestalotiopsis sp. ; 13 :葡萄炭疽病菌 Colletotrichum viniferum ;14 :葡萄灰霉 病菌Botrytis cinerea;15:葡萄白腐病菌Coniella diplodiella;16:葡萄蔓枯病菌 Diaporthe eres : 17是以ddH20为模板的PCR扩增结果。
[0021] 图3为本发明的引物B. d-F/B. d-R灵敏性检测的结果，泳道M为分子量 Marker (DL2000 DNA Marker)，泳道 1-7 分别是以浓度分别为 1，10 \ 10 2, 10 3, 10 4, 10 5， 10 Vg/μ L葡萄溃疡病菌葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)基因组DNA为模板的 PCR扩增产物。
[0022] 图4为本发明的引物N. p-F/N. p-R灵敏性检测的结果，泳道M为分子量 Marker(DL2000DNA Marker)，泳道 1-7 分别是以浓度分别为 1，10 \ 10 2, 10 3, 10 4, 10 5， 10 6 μ g/ μ L葡萄溃疡病菌小新壳梭孢（Neofusicoccum parvum)基因组DNA为模板的PCR 扩增产物。
[0023] 图5为本发明引物B. d-F/B. d-R和N. p-F/N. p-R的双重PCR反应验证结果，泳 道M为分子量Marker (DL2000DNA Marker)，泳道1为以已知含有葡萄溃疡病菌葡萄座腔菌 (Botryosphaeria dothidea)和小新壳梭抱（Neofusicoccum parvum)基因组DNA为模板的 双重PCR扩增产物。
【具体实施方式】
[0024] 为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0025] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可 从商业途径得到。
[0026] 实施例1、一组同时检测2种葡萄溃疡病菌的双重PCR引物及其检测方法
[0027] 一、葡萄溃疡病菌 Neofusicoccum parvum 和 Botryosphaeria dothidea 双重 PCR 引物的获得
[0028] 提取GeneBank中我国已报道的引起葡萄溃疡病菌的4个种（Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae、Neofusicoccum parvum 和 Diplodia seriata) 的EF延伸因子和β -tubul in序列（登录号分别为：JX462265 ;⑶294727 ;KJ146834 ; KJ146833 JX462263；JX462272 ；JX462280 ；HQ288289 JX462291 ；GU294713 ；KJ146836 ； KJ146835 JX462289 JX462299 JX462306 ;HQ288254 JX521848)进行同源性比较。根 据Botryosphaeria dothidea与其他3个种EF延伸因子序列上的差异位点设计出 Botryosphaeria dothidea的特异性引物B. d-F/B. d_R，序列分别为上游正向引物B. d_F 序列：5' -GTCTGCATCATTCTCAGCGTGGG-3'（序列表中序列1);下游反向引物B. d-R序列： 5'-TTACCCTCAGTGTAGTGACCCTTG-3'（序列表中序列 2)。根据 Neofusicoccum parvum 与其 他3个种β-tubul in序列上的差异位点，设计得到Neofusicoccum parvum的特异性引物 N. p-F/N. p-R，序列分别为：上游正向引物N. p-F序列：5' -CTCGGCGGCTTCCTGGGAT-3'（序列 表中序列3);下游反向引物N. p-R序列：5'-CGCACTCAATTTGCCTTATCGCTTC-3'（序列表中序 列4)。
[0029] 二、本发明的用于葡萄溃疡病菌 Neofusicoccum parvum 和 Botryosphaeria dothidea双重PCR引物的效果验证
[0030] 1、引物合成
[0031] B. d-F/B. d-R引物：上游正向引物B. d-F序列：
[0032] 5' -GTCTGCATCATTCTCAGCGTGGG-3'（序列表中序列 1);下游反向引物 B. d-R 序列： 5'-TTACCCTCAGTGTAGTGACCCTTG-3'（序列表中序列 2);
[0033] N. p-F/N. p-R引物：上游正向引物N. p-F序列：
[0034] 5' -CTCGGCGGCTTCCTGGGAT-3' ；下游反向引物 N. p-R 序列：
[0035] 5' -CGCACTCAATTTGCCTTATCGCTTC-3'，委托上海生工生物技术有限公司合成。
[0036] 2、特异性引物B. d-F/B. d-R和N. p-F/N. p-R的准确性验证
[0037] 2. 1菌株的采集和鉴定
[0038] 研究中所用菌株均采用常规组织分离法（方中达.植病研究方法[M].第三版.北 京：中国农业出版社.1998 :122-137.)分离自我国不同地区的葡萄病样上，获得了菌株的 纯培养，并通过接种实验完成了柯赫氏法则的验证。菌株信息如下：
[0039] 葡萄溃疡病菌分别为：3 株 Neofusicoccum parvum，3 株 Lasiodiplodia theobromae;2 株葡萄溃疡病菌 Botryosphaeria dothidea，2 株 Diplodia seriata。其 他菌株信息如下：2株葡萄穗轴褐枯病菌Alternaria viticola ;2株葡萄枝枯病菌 Neopestalotiopsis sp. ;2 株葡萄炭疽病菌 Colletotrichum viniferum;2 株葡萄灰霉病 菌 Botrytis cinerea;2 株葡萄蔓枯病菌 Diaporthe eres。
[0040] 2. 2菌株的鉴定采用形态学鉴定和分子生物学鉴定
[0041] 对上述菌株的鉴定采用形态学鉴定和分子生物学鉴定2种方法。首先观察28°C黑 暗培养箱中培养3-7d的菌落形态，并在显微镜下观察产孢结构特征以及分生孢子形态和 颜色等，对菌株种类进行初步确定。进一步采用PCR技术对菌株种类进行分子生物学鉴定， 具体方法如下：
[0042] 采用CTAB法提取菌株DNA，PCR扩增其rDNA-ITS区段用于菌株种类鉴定。PCR反 应体系为：了39 0嫩聚合酶（51]/^1^)0.25 4 1^，10\缓冲液（含100臟〇1/11^8-!1(：1?!18.3， 500mmol/L KCl，15mmol/L Mg2+)2. 5yL，dNTP (各 2. 5臟〇171)2以1^，1(^111〇1/1引物1丁51(序 列为：5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和 ITS4(序列为：5' -TCCTCCGCTATGAATGC-3'）各 〇. 5 μ L，模板5-20ng，用双蒸水将反应体系补充至25 μ L。PCR反应条件：94°C预变性4min ; 94°C 30s，59°C 30s，72°C 30s，35 个循环；72°C延伸 5min。PCR 产物的检测：取 5 μ L PCR 扩 增产物于〇. 8 %的琼脂糖凝胶上电