组血清中目标miRNA表达情况进行 了定量分析，采用U6作为内标，结果表明miRNA在血清中稳定表达，采用U6作为内参稳定 可靠。
[0148] 2. 2卵巢癌患者及对照组血清中目标miRNA表达情况
[0149] 对照组与卵巢癌组 has-miR-155_5p、has-miR-132_3p、has-miR-145_5p、 has-miR-143-3p及has-miR-193b-3p相对表达量比较，差异均有统计学意义（P < 0. 05)。 [0150] 数据见下表。
[0152] 本发明利用miRNA芯片对8对卵巢癌组织及配对的癌旁组织中miRNA表达谱进行 了分析，共筛选出20种差异性表达的miRNA，实时荧光定量RT-PCR对芯片结果进行了验证， 共筛选出 9 种差异性表达的 miRNA，其中 has-miR-132-3p、has-miR-143_3p 和 has-miR-497 表达上调，has-miR-155_5p、has-miR-145_5p、has-miR-381、has-miR-497、has_miR-99a、 has-miR-193b-3p表达下调。肿瘤的发生是一系列分子生物学行为改变累计的结果，涉及到 细胞周期、细胞凋亡、增殖分化等各个方面，因此应该有一系列miRNA表达的改变参与肿瘤 的发生，基因芯片的结果验证了这一假设，多种miRNA的表达发生了改变。
[0153] 表达差异明显（差异表达量大于2个fold，RT-PCR中CT值小于30)的5种miRNA， has-miR-193b_3p、has-miR-155_5p、has-miR-132_3p、has-miR-145_5p 及 has-miR-143_3p 进行进一步的血清学表达分析。结果表明miRNA在血清中稳定表达，血清miRNA的表达与 组织具有很好的一致性，has-miR-193b-3p、has-miR-155_5p 和 has-miR-145_5p 表达下调， has-miR-132_3p和has-miR-143_3p表达上调。该结果表明，这5种miRNA可以作为卵巢癌 诊断的生物标志物。
[0154] 实施例3 :受试者工作特征曲线（ROC)分析
[0155] 构建ROC曲线来比较5个血清miRNA区分卵巢癌病人和健康对照的诊断能 力。5个miRNA ROC曲线下面积（AUC)分别为：has-miR-193b-3p，0.840(95%置信区间： 0· 760-0. 920) ;has-miR-155-5p，0. 819(95 % 置信区间：0· 736-0. 902) ;has-miR-145-5p， 0.814(95 % 置信区间：0.734-0. 894) ;has-miR-132-3p，0.843 (95 % 置信区间： 0· 765-0. 920) ;has-miR-143-3p，0· 738 (95 % 置信区间：0· 644-0. 832)。在最佳的 cut off值下，miRNA的灵敏度和特异性如下：has-miR-193b-3p，分别为83. 3 %和82. 7 % ; has-miR-155-5p，分别为 64. 8 % 和 94. 2 % ;has-miR-145-5p，分别为 90. 7 % 和 61. 5 % ; 11&811丨1?-132-3口，分别为70.4%和82.5%;1^811丨1?-143-3口，分别为67.3%和74.1%。这 5个miRNA联合起来的AUC可以达到0. 973,灵敏度和特异性分别为92. 3%和90. 7%，明 显优于单个 miRNA。该结果表明，has-miR-193b_3p、has-miR-155_5p、has-miR-145_5p、 has-miR-132-3p和has-miR-143-3p联合起来对卵巢癌检测具有非常高的灵敏度和特异 性。
[0156] 实施例4 :人卵巢癌诊断用试剂盒
[0157] 上述实施例表明，has-miR-193b_3p、has-miR-155_5p、has-miR-145_5p、 has-miR-132-3p和has-miR-143-3p联合起来对卵巢癌检测具有非常高的灵敏度和特异 性，因此，可基于 has-miR-193b_3p、has-miR-155_5p、has-miR-145_5p、has-miR-132_3p 和 has-miR-143-3p制作用于人卵巢癌诊断用的试剂盒。该试剂盒包括has-miR-193b-3p引 物、探针；has-miR-155-5p 引物、探针；has-miR-145-5p 引物、探针；has-miR-132-3p 引物、 探针；has-miR-143-3p引物、探针。引物具体包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR 后引物。当然，该试剂盒中还应该包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水、Taq酶以 及标准品和/或对照品。下表为引物和探针的一种设计。
[0158] CN 105177173 A 说明书 13/13 页
[0159]引物和探针的设计是本领域常规技术手段，可以设计成其他序列。上述实施例的 作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技 术人员可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质 和保护范围。
【主权项】
1. 一组用于人卵巢癌诊断的microRNA生物标志物，其特征在于，所述microRNA生 物标志物由如下microRNA组成：has-miR-193b_3p、has-miR-155_5p、has-miR-145_5p、 has-miR-132-3p和has-miR-143-3p;所述has-miR-193b-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.I 所示；所述has-miR-155-5p的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示；所述has-miR-145-5p的核 苷酸序列如SEQIDNO. 3所示；所述has-miR-132-3p的核苷酸序列如SEQIDNO. 4所示； 所述has-miR-143-3p的核苷酸序列如SEQIDNO. 5所示。2. 根据权利要求1所述的用于人卵巢癌诊断的microRNA生物标志物，其特征在于：所 述microRNA生物标志物为人血清microRNA生物标志物。3. 权利要求1或2所述的microRNA生物标志物在筛选人卵巢癌的肿瘤诊断药物中的 用途。4. 一组人卵巢癌诊断用microRNA引物、探针的组合，其特征在于，所述microRNA 引物、探针的组合包括：has-miR-193b-3p引物、探针；has-miR-155-5p引物、探针； has-miR-145_5p引物、探针；has-miR-132_3p引物、探针；has-miR-143_3p引物、探针。5. 根据权利要求4所述的人卵巢癌诊断用microRNA引物、探针的组合，其特征在于： 所述microRNA引物包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物。6. 根据权利要求5所述的人卵巢癌诊断用microRNA引物、探针的组合，其特征在于： has-miR-193b-3p的反转录引物序列如SEQIDNO. 6所示，定量PCR前引物序列如SEQID NO. 7所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO. 16所示；has-miR-155-5p的反转录引物序列 如SEQIDNO. 8所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO. 9所示，定量PCR后引物序列如SEQ IDNO. 16所示；has-miR-145-5p的反转录引物序列如SEQIDNO. 10所示，定量PCR前引物 序列如SEQIDNO. 11所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO. 16所示；has-miR-132-3p 的反转录引物序列如SEQIDNO. 12所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO. 13所示，定量 PCR后引物序列如SEQIDNO. 16所示；has-miR-143-3p的反转录引物序列如SEQIDNO. 14 所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO. 15所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO. 16所 示；各microRNA探针的核苷酸序列如SEQIDNO. 17所示。7. 权利要求4-6任一所述的人卵巢癌诊断用microRNA引物、探针的组合在制备或筛选 人卵巢癌的肿瘤诊断药物中的用途。8. -种人卵巢癌的肿瘤诊断试剂盒，其特征在于：包括权利要求4-6任一所述的miRNA 引物、探针的组合。9. 根据权利要求8所述的人卵巢癌的肿瘤诊断试剂盒，其特征在于：还包括逆转录酶、 缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水、Taq酶以及标准品和/或对照品。
【专利摘要】本发明公开了用于卵巢癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒，所述microRNA生物标志物由如下microRNA组成：has-miR-193b-3p、has-miR-155-5p、has-miR-145-5p、has-miR-132-3p和has-miR-143-3p。本发明将卵巢癌与癌旁组织表达差异明显(差异表达量大于2个fold，RT-PCR中CT值小于30)的5种miRNA？has-miR-193b-3p、has-miR-155-5p、has-miR-132-3p、has-miR-145-5p及has-miR-143-3p进行血清学表达分析，结果表明这5种miRNA在血清中稳定表达，血清miRNA的表达与组织具有很好的一致性，has-miR-193b-3p、has-miR-155-5p和has-miR-145-5p表达下调，has-miR-132-3p和has-miR-143-3p表达上调。这5种miRNA可以作为卵巢癌诊断的生物标志物，且联合诊断的灵敏度与特异性显著高于单一miRNA诊断的灵敏度和特异性。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105177173
【申请号】
【发明人】崔长友
【申请人】崔长友
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年11月2日