多模态白细胞分子探针化合物、制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一系列靶向甲酰肽受体并具有体内白细胞造影示踪及体外病理组织 显色的多功能探针化合物。该类分子探针化合物由甲酰肽受体靶向小分子肽、核影像同位 素和小分子荧光发光基团三部分组成，集活体核、光显像及组织、血液显色分析功能于一 体，可应用于临床上各种无菌和有菌炎症的核显像、荧光显像及病理组织显色、血液分析。 本发明涉及该系列化合物、合成方法，并已通过动物的有菌和无菌炎症模型实验进一步验 证了其药理作用。
【背景技术】
[0002] 目前，白细胞的激活和炎症部位的侵入在临床上进行精确的定量确诊仍是个难 题，其中能够及时掌握白细胞的激活原因、炎症病变组织内的侵入及其变化过程在诊断和 治疗中起着至关重要的作用如参考文献[1，2]。临床上使用最多的方法是通过各种参数和 影像学方法来判断炎症的部位、原因、过程和程度，并进行某一针对性地实施治疗，其中包 括核影像方法，如roG/PET参考文献[3，4 ]、放射性标记的白血细胞(111 In或99mTc-WBC/ECT) 参考文献[5] JDG/PET的缺点是其对炎症的特异性差，仅用于某些特定的病理状态。自上世 纪70年代以来，mIn/ 99mTc-WBC依然是炎症影像的金标准参考文献[5]，其标记后的白细胞 能自发寻找并汇集于炎症发生部位，但操作复杂，成本高昂，灵敏性低，且目前还没有 mIn /99mTc-WBC用于无菌炎症显像的报道。
[0003] 为了更好地进行炎症临床影像的研究，迫切需要一种特异性高、简单易行的多模 态分子探针化合物，不仅能运用于体内显像，也可用于体外组织显色、血液分析验证。
[0004] 参考文献如下：
[0005] l.Lazzeri,E. ,et al . , Radionucl ide Imaging of Infection and Inflammation.Vol.XVI.2013:Springer.
[0006] 2. Kielland , A. and H.Carl sen ,Molecular imaging of transcriptional regulation during inflammation.Journal of Inflammation,2010.7(1):p.20.
[0007] 3·FDG PET of Infection and Inflammation·RadioGraphics，2005·25(5): p.1357-1368.
[0008] 4. Vos ,F.J.,F.H.M.Corstens, and ff.J.G.Oyen, Imaging of infectious diseases using[18F]fluorodeoxyglucose PET.The Quarterly Journal of Nuclear Medicine&Molecular Imaging,2008.52(1):p.17-29.
[0009] 5.Thakur,M.L.,et al· ，Indium-111-labeled autologous leukocytes in man.Journal of Nuclear Medicine,1977.18(10):p.1014-21.
【发明内容】
[0010] 本发明的目的提供一种模块式排列组合的合成方式，通过一个化学链接基团也就 是赖氨酸、半胱氨酸和聚乙二醇，将放射性同位素螯合基团和近红外荧光发光基团，与六肽 化合物cFLFLF(cinnamoy 1-pheny lalanine-(D) leucine-phenylalanine-(D) leucine-phenylalanine)连接，构建一系列革E向FPR的多功能显像、显色试剂，并已通过体外评价实 验验证了该系列前体化合物与放射性同位素螯合之后的多模态探针的稳定性、与甲酰肽受 体(FPR)的结合强度(KD)、在体外和体内各种条件下针对FPR的特异性及动物炎症模型上的 有效性。通过多模态白细胞分子探针化合物与FPR的作用，使用核影像、光学影像、体外组织 显色和血液分析等显影显色方法，在体内外追踪白细胞的激活，转移和侵入，这种单一多模 态白细胞分子探针示踪化合物有利于各种白细胞示踪方法的相互验证，有利于临床上炎症 显像技术的普及。
[0011]炎症的即时定量显像显色能为各种疾病的诊断和治疗提供一种重要指标。截至目 前，临床上仍缺乏一种特异性好，敏感性高且简便易行的影像方法。已有的roG/PET和67Ga/ ECT方法缺乏针对炎症组织和免疫细胞的特异性，而临床金标准方法，mIn/99mTc-WBC/ECT 又受限于方法本身的操作复杂（需要体外白细胞分离和标记，然后回注病人体内），灵敏度 低、成本高昂，无法得到广泛普及，且也未见有关 mIn/99mTc-WBC/ECT在无菌炎症显像应用 的报道。另外，目前体外组织和体液中白细胞的检测主要是通过抗体类显色试剂来完成。因 为与现有活体白细胞显像试剂不是同一化合物，因而无法相互验证分析结果。通过这项发 明，我们开发验证了一系列多功能、多模态FPR靶向探针化合物。该系列探针化合物由一个 靶向白细胞FPR受体的小分子肽cFLFLF，cFLFLF与放射性同位素螯合基团及荧光发光基团 通过化学链接基团（赖氨酸、半胱氨酸和聚乙二醇)构建组成如图1所示，用于炎症的研究， 诊断定位及治疗效果的早期评估。即通过该多模态探针结合PET(正电子发射断层扫描）、 SPECT(单光子发射计算机断层成像术）、活体荧光光学显像仪、荧光显微镜、激光扫描共聚 焦荧光显微镜或流式细胞仪等技术，诊断炎症病理变化过程中免疫白细胞的激活，转移和 侵入。本发明涵盖了这一类化合物的模块式组成、合成方法及其未来在临床上的应用范围。 [0012]本发明通过以下技术方案解决了上述技术问题：
[0013]本发明使用具有甲酰肽受体(FPR，高表达于免疫激活的白细胞表面)特异靶向性 的六肽化合物cFLFLF，与核素和荧光基团结合，在血液和炎症病灶组织中与白细胞结合并 示踪白细胞在活体体内的分布。该方法避免了病人血液白细胞的分离和标记。探针化合物 直接通过静脉注射进入患者体内，探针与体内免疫白细胞的特异性结合，通过活体扫描诊 断炎症并发部位和程度。在体外应用方面，该探针化合物能够选择性的与组织切片或体液 中的白细胞结合，再通过各种荧光显色仪器(显微镜或流式细胞仪等)达到定量示踪白细胞 的目的。该系列多功能探针化合物cFLFLF-Fl- 99mTc(式IV)，cFLFLF-Fl-68Ga(式VI)，and cFLFLF-F1-A1 18F(式VII)已初步进行了一系列体内外评估实验。体内药物评估实验包括： cFLFLF-Fl-99mTc小鼠中脑动脉闭塞实验后，大脑体外的放射性自显影和近红外荧光显像， cFLFLF-Fl-68Ga (式VI)在主动脉弓和腹主动脉上的摄取分布，cFLFLF-Fl-A118F小鼠缺血再 灌注后，心肌组织体外切片的放射性自显影和近红外荧光显像，以及cFLFLF-Fl- 99mTc在流 式细胞仪上的应用；体外药物评估实验包括:在血清中的稳定性以及与人体中性粒细胞的 结合常数数据。
[0014]本发明的另一个优点是所有前体化合物的合成都采用了固相合成方法，此方法简 化了中间化合物的分离提纯，降低了化合物合成制备难度以及成本，有利于技术推广和普 及。一个方面，本发明提供了 FPR靶向多模态白细胞分子探针化合物的前体化合物与放射性 同位素络合后生成的多模态白细胞分子探针化合物(式I):
[0015] 式I如图8所示。
[0016]
[0017] 其中：
[0018] cFLFLF代表六肽化合物cinnamoyl-phenylalanine-(D) leucine-phenylalanine-(D)leucine-phenylalanine；
[0019] linker代表聚乙二醇PEG、赖氨酸和半胱氨酸；
[0020] fluorophore(Fl)代表荧光基团或取代基团：4-( (E)-2-((E)-2-(3-( (E)-2-(3,3-dime thy 1-1-( 4-sulfonatobuty 1 )-3H-indol-1-ium-2-yl) vinyl) eye lohex-2-en-1-ylidene)ethylidene)-3,3-d imethylindolin-1-yl)butane_l-sulfonate或_H;
[0021] chelat〇r(Che)代表同位素螯合基团：6-肼基烟酸(HYNIC)或1，4,7_氮杂环壬烷-1，4,7_ 三乙酸（N0TA);
[0022] rad i onuc 1 i de (RN)代表放射性同位素 99mTc、68Ga或Al 18F 〇
[0023] 另一方面，所述化合物为cFLFLF-Fl-99mTc(式II)，cFLFLF-Fl-68Ga(式III)， CFLFLF-F1-A118F(式IV)，cFLFLF-PEG24-99mTc(式V)，cFLFLF-PEG24- 68Ga(式VI)，cFLFLF-PEG24-A118F (式 VII);
[0024] 式II，cFLFLF-Fl-99mTc;
[0025] 式III，cFLFLF-Fl-68Ga;
[0026] 式IV，cFLFLF-F1_A118F:
[0032] 另一方面，本发明提供了上述探针化合物【cFLFLF-Fl-99mTc(式II)，cFLFLF-Fl-68Ga(式III)，和cFLFLF-F1-A1 18F(式IV)的制备方法(见具体实施方法）。
[0033] 所述多模态白细胞核素探针化合物cFLFLF-Fl-99mTc(式II)、cFLFLF-Fl-68Ga(式 III)或CFLFLF-F1-A118F (式IV)的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：
[0034] (1)前体化合物:使用多肽合成仪，通过标准的氯甲酸芴甲酯(Fmoc)化学，在王树 脂(wang resin)上逐步親联生成化合物1，脱去侧链的保护基团4-甲基三苯甲基(MTT)后， 与Fmoc-N-amid〇-PEG24-Acid耦联生成化合物2,进一步脱去Fmoc保护，与N-(9-芴)-S-三苯 甲基-L-半胱氨酸(?111〇〇-〇78(1'1'1:)-〇!〇親联生成化合物3，在化合物3的结构上去?1]1〇〇保护 后，与2，5-二氧代吡咯烷-1-基-6-(2-(叔丁氧基羰基)肼基)烟酸(NHS-HYNIC-Boc)或2，2'， 2"-(6-(4_异硫氰酸苯）-1,4- diazonane-l，4,7-三基）三乙酸（p-SCN-Bn-NOTA)耦联，然后 在质量浓度为1 %的三氟乙酸一二氯甲烷中将wang resin切割和半胱氨酸侧链巯基上的保 护基团三苯甲基（Trt)脱掉，生成cFLFLFK-PEG24 (SH) -HYNKX化合物4)或CFLFLFK-PEG24 (SH)-N0TA(化合物5)，经高效液相色谱法HPLC纯化之后，化合物4或化合物5上的巯基分别 与IR-783耦联生成双标记探针前体化合物cFLFLF-Fl-HYNIC(化合物6)或双标记探针前体 化合物cFLFLF-Fl-N0TA(化合物7)。
[0035] (2)cFLFLF-F 1 -99mTc(式II):取50yg cFLFLF-Fl-HYNIC(6)，称取6·7mg的甘氨酸 (trici