百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图 谱的获取方法。
【背景技术】
[0002] 百合化ilium SPP.)被誉为"球根花弁之王"，是世界五大鲜切花之一。据统计， 2009年全球种球生产面积为35,749公顷，其中荷兰种植面积为23,561公顷，占66%，英国种 植面积为5，400公顷，占15 %，中国种植面积为4，680公顷，占13 %。全球百合种球的贸易额 已达20多亿美元，年贸易量达25亿粒W上。据农业部的统计数据，我国2013年百合鲜切花销 售额达42.95亿元，位居鲜切花销售额的首位，具有重要的经济价值。
[0003] 尖抱镶刀菌百合专化型(化sarium O巧sporum f .sp. Iilii)是引起百合枯萎病的 ±传真菌，全世界百合种植区域均有被其感染和危害。云南作为我国重要的百合优质鲜切 花产区，枯萎病时有爆发，轻者导致产量损失20-30%，严重时可造成百合绝收，且污染种植 ±壤，极大影响云南百合花弁产业的可持续发展。镶刀菌是一种在许多作物上引起严重病 害的±传真菌，很难进行有效控制。因此选育和利用抗病品种成为主要的防治措施，采用蛋 白质双向电泳技术来挖掘百合的抗病相关蛋白，可为百合抗病细胞工程育种提供理论依 据。
[0004] 植物在病原侵染胁迫下，除了会发生一些组织解剖学上的变化外，一些基因表达 也会发生改变，有些蛋白的合成会受到抑制，同时又会有新的蛋白合成。运些病程相关基因 和蛋白（Pathogenesis-related gene/protein,PR)是植物表现抗性的遗传基础抗性中的 关键因子，也是抗病机制研究的基础。研究百合的病程相关蛋白可为抗病细胞工程育种提 供理论依据。
[0005] 双向电泳（Two-dimensional electro地oresis ,2-DE)技术是蛋白质组研究的核 屯、技术之一，也是复杂蛋白质分析分辨率最高的工具之一，其第一向为等电聚焦 (IsoelectrofocusingJEF)，根据蛋白的等电点不同进行分离；其第二向为十二烷基硫酸 钢聚丙締酷胺凝胶(SDS-PAGE)，是根据蛋白质亚基相对分子质量的不同而将第一向分离后 的蛋白质进一步分离。经过电荷和质量的两次分离后，可W得到蛋白质分子的等电点和分 子量信息。近年来，蛋白质双向电泳技术在水稻、小麦、棉花、玉米、大豆等作物的研究中已 得到广泛应用，但对于百合蛋白质双向电泳技术的研究国内外还未见报道。因此本发明通 过优化百合蛋白质提取及双向电泳的各项参数，发明了百合总蛋白的提取及双向电泳差异 蛋白质图谱的获取方法。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种适宜百合的百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图 谱的获取方法。
[0007] 本发明所提供的百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，包括 W下步骤：
[000引（1)百合总蛋白质的提取：
[0009] ①称取1~2g新鲜百合叶片或鱗茎于-20°C预冷的研鉢中，加入10~20ml液氮，快 速研磨至粉状；
[0010] ②量取20ml附加1 %苯甲基横酷氣和0.1 %二硫苏糖醇的10 % S氯乙酸-丙酬溶 液，分2~3次清洗研鉢，将研鉢内粉状物清洗至50ml离屯、管中，迅速置于-20°C冰箱中保存 过夜;取过夜的离屯、管于离屯、机上2000化pm，离屯、20min;弃上清；
[00川③加入20ml附加1%苯甲基横酷氣和0.1%二硫苏糖醇的80%的丙酬溶液，用枪头 把离屯、管内的沉淀弄碎，振荡，于-20°C冰箱中放置化后，取出离屯、管于离屯、机上200(K)rpm， 离屯、15min，弃上清；
[0012] ④重复步骤(1)③2次；
[0013] ⑤在超净工作台上将得到的沉淀转移到经干燥灭菌的培养皿中，待沉淀吹干后， 即为提取的蛋白质干粉，将蛋白质干粉收集到离屯、管中，-80°C保存；
[0014] (2)百合总蛋白质的纯化和溶解
[0015] ①称取步骤（1)⑤提取的蛋白质干粉40~50mg于底部连接有离屯、管的过滤柱中， 按每Img蛋白质干粉加7M水化液15iil的比例，加入7M水化液，加入7M水化液后室溫放置化；
[0016] ②将底部连接有离屯、管的过滤柱于离屯、机上120(H)巧m，离屯、15min，然后弃去过滤 柱，将过滤柱底部连接的离屯、管所收集到的滤液转移至另一离屯、管中；
[0017] ③加入1600~2000iil附加0.1 %二硫苏糖醇的无水丙酬，边加边摇匀，-20°C冰箱 中放置化后，取出离屯、管于离屯、机上1500化pm，4°C离屯、30min，弃上清；
[0018] ④加入1ml在4°C预冷的附加0.1 %二硫苏糖醇的超纯水，在离屯、机上1500化pm，4 °C离屯、25min，弃上清；
[0019] ⑤加入附加化Vml载体两性电解质和0.01 %二硫苏糖醇的7M水化液150~20化1 即为百合总蛋白质溶解液；
[0020] (3)百合总蛋白质溶解液的质量检测
[0021] ①将双层玻璃板竖直夹在灌胶架上，且双层玻璃板的上方朝上并使双层玻璃板上 方顶端面为水平，在双层玻璃板之间灌入10%的分离胶，灌入的所述分离胶的上方顶面距 离双层玻璃板中的短玻璃板的上方顶端面2cm，在所述分离胶上方顶面用无水乙醇封面，待 所述分离胶聚合且所述分离胶与无水乙醇分层后，倒去无水乙醇，然后在所述分离胶上方 顶面灌入5%的浓缩胶，灌入的所述5%的浓缩胶的上方顶面距离双层玻璃板中的短玻璃板 的上方顶端面1cm，插入点样梳，待所述浓缩胶聚合凝固后，将此双层玻璃板转入蛋白质电 泳槽中，并在蛋白质电泳槽中加入IX电泳缓冲液，拔去点样梳，形成加样孔，用注射器针尖 将加样孔内壁凸起的浓缩胶去掉使加样孔内壁平滑;取步骤步（2)⑤获得的百合总蛋白质 溶解液化1，加入化1的漠酪蓝指示剂混匀后加入加样孔中，加样完毕后，接通电源，起始时， 用低电流5mA电泳或用低电压50V电泳，待漠酪蓝指示剂成一条线后，再加大电流为IOmA电 泳或加大电压为150V电泳，待漠酪蓝指示剂达到该双层玻璃板底部边缘时停止电泳;所述 双层玻璃板为宽度相等长度不等的两块玻璃板重叠放在一起且长玻璃板和短玻璃板一端 对齐，长玻璃板和短玻璃板没有对齐的一边为双层玻璃板的上方，其长玻璃板和短玻璃板 的宽度均为IOcm,长玻璃板的长度为8cm，短玻璃板的长度为7cm;
[0022] ②停止电泳后，擦开双层玻璃板，从双层玻璃板中取出凝胶置于附加20%甲醇的 考马斯亮蓝G250染液中染色，再用脱色液脱色后，置于校准型光密度仪上拍照并保存文件， 如果胶图条带清晰且无拖尾，表明所提取出来的蛋白质质量好，继续进行下一步百合总蛋 白质的浓度测定；
[0023] (4)百合总蛋白质的浓度测定
[0024] 取步骤(2)⑤获得的百合总蛋白质溶解液采用化a壯ord法测定其百合总蛋白质的 浓度，测定的百合总蛋白质浓度在化g/山W上，将步骤步(2)⑤获得的百合总蛋白质溶解液 置于-80°C保存；
[0025] (5)第一向等电聚焦 [00%]①上样水化
[0027]用与步骤(2)⑤中相同的附加化Vml载体两性电解质和0.01%二硫苏糖醇的7M水 化液将步骤(4)中于-80°C保存的百合总蛋白质溶解液稀释至化g/iil，取所稀释的浓度为化 g/山的百合总蛋白质溶解液30化1放入聚焦盘的槽内，做好标记，把预先解冻的固定化pH梯 度胶条的保护膜去掉，然后将固定化抑梯度胶条沿聚焦盘的一端放入聚焦盘的槽内与聚焦 盘槽内的百合总蛋白质溶解液结合，让聚焦盘槽内的百合总蛋白质溶解液被固定化抑梯度 胶条吸收2-3min，再在固定化pH梯度胶条上加入2~3ml矿物油水化14~16h;
[002引②聚焦
[0029] 将盐桥用dd此0润湿后置于聚焦盘两端;对好正、负极，盖上盖子，设置等电聚焦程 序进行聚焦，所述的等电聚焦程序如下： 步骤 电压 梯度 时间 Sl除盐 250V 快逮 2,知 S2除盐 1000 V 快速 2 5h
[0030] S3升压 養OOV 线性 4細 S4 聚焦 9()00￥ 快壤 65Q00v/h S5保持 500V 快速 5h 1:
[0031] ③第一次平衡；
[0032] ④第二次平衡；
[0033] (6)第二向 SDS-PAGE 电泳；
[0034] (7)染色、脱色；
[0035] (8)图像采集，获得百合总蛋白双向电泳差异蛋白质图谱。
[0036] 与现有技术相比，本发明的主