一种人源化抗白介素22基因工程抗体及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种人源化抗白介素22 (inter leukin-22，IL-22)基因工程抗体的制备方法以及在Thl7/IL-17相关自身免疫性疾病中的用途。
【背景技术】
[0002] 11117细胞是近年来新发现的1'细胞亚群，主要分泌11^-174，几-17?，11^-21和11^-22。11117细胞的主要作用是参与宿主防御真菌及细菌，但是许多研究发现Thl7/IL-17在许 多自身免疫性疾病如银肩病，红斑狼疮，多发性硬化症，炎症性肠病等疾病以及肿瘤的发生 发展中发挥十分重要的作用、
[0003] Thl7/IL-17的主要功能是对抗细菌以及真菌的感染，但是在激活宿主防御的过程 中，经常伴有炎症细胞浸润为主的局部炎症反应，以及活性氧的产生，因而不可避免的产生 组织损伤。特别是在各种因素导致的慢性炎症过程中，Thl7招募的中性粒以及巨噬细胞等 骨髓起源的细胞常常会造成严重的局部组织损伤甚至自身免疫疾病的发生。通过运用各种 Thl7/IL-17相关基因敲除小鼠的研究证实了Thl7/IL-17对于众多的自身免疫性疾病银肩 病，红斑狼疮，多发性硬化症，炎症性肠病等疾病的发生发展中发挥十分重要的作用、Eli 1^117，如似^&等众多制药公司研发了许多针对11117/11^-17的抗体和药物，针对众多的自 身免疫性疾病开展了临床试验。其中针对IL-17以及IL-17受体的人源化单克隆抗体在治疗 银肩病以及银肩病性关节炎方面取得了较好的疗效。现在抗IL-17的抗体治疗银肩病已进 入III期临床实验。从临床实验的结果来看，尽管针对IL-17的抗体具有非常好的效果，但还 有20%左右的患者对IL-17中和不产生任何反应，40%左右的患者反应较差 2。针对IL-17受体 的抗体用于治疗银肩病性关节炎也进入临床II期实验，从结果上来看，尽管也有一定的疗 效，但也有高达50%左右的患者对治疗不起任何反应 3。针对IL-17的中和抗体治疗在多发性 硬化症，关节炎以及炎症性肠病方面的临床实验结果不是很好，提示可能具有更加复杂的 机制参与这些疾病中。
[0004] 白介素22 (IL-22)属于IL-10家族细胞因子，其主要由Thl7, γδ T细胞，NKT细胞 以及最新鉴定的ILC细胞分泌。IL-22在众多的组织中均有表达，如肠，肺，肝脏，肾脏，胸腺， 胰岛和皮肤等。IL-22的主要生理学功能是促进细胞增殖，再生以及宿主防御。但是近些年 的研究发现IL-22在众多自身免疫性疾病中发挥十分重要的作用，如银肩病，特应性皮炎， 关节炎，红斑狼疮，炎症性肠病等。通过基因敲除IL-22小鼠以及中和IL-22研究发现，IL-22 可以作为银肩病、特应性皮炎以及炎症性肠病的治疗靶点。
[0005] Actl是IL-17信号通路最重要的接头分子，对于IL-17信号转导具有至关重要的作 用。近年来，研究发现Actl的单核苷酸多态性与许多自身免疫性疾病密切相关，如银肩病、 炎症性肠病、红斑狼疮等。我们的一个研究发现Actl的一个单核苷酸多态性导致银肩病的 分子机制，并且运用小鼠模型证明在Actl缺失/突变造成的皮肤炎症中IL-22扮演十分重要 的角色。由此，发现抗IL-22抗体能够改善Act 1缺失/突变造成的皮肤炎症，提示抗IL-22抗 体可以作为抗IL-17抗体的补充治疗方法来应用(见说明书附图1和图2) 4。我们和临床合作 的一个课题发现，对抗IL-17抗体治疗不反应的这部分银肩病病人中，Actl的突变率非常 高。因此，对于抗IL-17抗体不反应的这一部分病人，可以采取抗IL-22抗体治疗，应该会有 很好的效果，考虑到Thl7/IL-17参与众多自身免疫性疾病，抗IL-22抗体可以作为抗IL-17 抗体治疗的补充治疗方法，具有十分广泛的治疗和应用前景。
[0006] 然而，鼠源性抗体应用于人体治疗中存在诸多问题：（1)不能有效地激活人体中补 体和Fc受体相关的效应系统；（2)被人体免疫系统所识别产生人抗鼠抗体(HAMA) ; (3)在人 体循环系统中被很快清除掉。因此，人源化单链抗体的研究是目前抗体研究的热点之一。
[0007] 参考文献： 1. Gaffen SL, Jain R, Garg AV, Cua DJ. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing.Nat Rev Immunol. 2014 Sep; 14(9): 585-600. 2. Mease PJ. et al. Brodalumab, an anti_IL17RA monoclonal antibody, in psoriatic arthritis.N Engl J Med. 2014 Jun 12; 370(24): 2295-306 3. Langley RG, et al. Secukinumab in plaquepsoriasis-results of two phase 3 trials.N Engl J Med. 2014 Jul 24; 371(4): 326-38. 4. Wang C, et a 1. The psoriasis-associatedD1ONvariant of the adaptorActlwith impaired regulation by the molecular chaperone hsp90.Nat Immunol. 2013 Jan; 14(1): 72-81〇
【发明内容】
[0008] 为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种人源化抗IL-22基因工程抗体。
[0009] 本发明是通过以下技术方案来实现： 本发明通过运用基因工程技术以及噬菌体表面展示技术，直接从人抗体基因库中筛选 能与人IL-22结合的抗体，获得抗体基因并表达。
[0010] -种人源化抗IL-22抗体，包括重链和轻链，所述的重链的可变区的3个互补决定 区序列分别为： CDR1：Gly- lie -Thr -Gly -Ser -Arg- Tyr- Trp； CDR2：Ile- Tyr- Thr -Asp -Gly -Ser- Thr -Thr； CDR3:Ala_ Arg -Pro- Thr -Asp- Gly -Val- Asn -Val -Thr- His- Asp- Tyr； 所述的轻链的可变区的3个互补决定区序列分别为： CDRl：Gln- Ser -Val -Gly -Ser -Asn； CDR2:Gly- Ala -Ser; CDR3：Gln -Gin- Tyr- Gly- Ser -Ser- Pro- Gin- Thr； 考虑到密码子的简并性，可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，编码上述Fab 段抗体的基因序列可以进行修改，获得编码相同抗体的基因；也可以根据表达抗体宿主的 密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
[0011] 进一步地，本发明将上述Fab抗体的轻链可变区和重链可变区进行重组，获得分子 量更小的单链抗体(ScFv)，该抗体同样能够特异性识别人IL-22。
[0012]此外，可将上述Fab抗体的轻链编码基因和重Fd段基因克隆到全抗表达载体中，并 导入宿主细胞中，获得表达抗人IL-22的全抗免疫球蛋白。
[0013]在本发明的实施例中，将上述Fab抗体的轻链和重Fd段基因分别克隆入全抗体表 达载体pAC-K-Fc并转染昆虫Sf9细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现了全抗体的分泌 型表达，得到抗人IL-22全抗体。
[0014] 本发明的另一个目的是提供所述的人源化抗IL-22抗体在制备治疗Thl7 /IL-17 相关自身免疫性疾病的药物中的应用。
[0015] 所述的Thl7/IL-17相关自身免疫性疾病包括银肩病，特应性皮炎，类风湿关节炎， 红斑狼疮，炎症性肠病，多发性硬化症，I型糖尿病。
[0016] 本发明的IL-22人源化抗体将作为抗IL-17抗体治疗的补充治疗方法，尤其是针对 抗IL-17抗体治疗效果不明显或完全不起反应的病人。
【附图说明】
[0017 ]图1为抗IL-22抗体中和治疗的Act 1 -/-小鼠皮肤炎症状况不意图。
[0018]三周龄Actl-/-小鼠给予非特异性IgG或者抗IL-22抗体腹腔注射（500yg每只每 次，一周三次，持续三周）。三周后，处死小鼠，取背部皮肤做H&E染色，CD3染色，CD4染色， ⑶lib染色。可以看出抗IL-22抗体中和治疗明显改善Actl-/-小鼠皮肤炎症状况。
[0019]图2为抗IL-22抗体中和治疗的AcU-/_小鼠皮肤炎症基因表达示意图。
[0020] 三周龄Actl-/-小鼠给予非特异性IgG或者抗IL-22抗体腹腔注射（500y