采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种检测细胞内特定mRNA的方法，特别涉及一种通过分子探针荧光寿命成像来检测细胞内特定mRNA的方法。
【背景技术】
[0002]癌症是全世界人类死亡的重要病因，因此癌症的早期检测和治疗成为医学和生物研究领域的一个重要挑战。研究者已经证明，内生性癌症相关的mRNA是患癌的重要指标，而且他们的表达水平能够揭示癌症进程与预后信息。因此，对细胞内癌症相关的mRNA的识别和鉴定能够为癌症的早期诊断和治疗提供重要的信息。目前，已经有很多方法来识别和鉴定mRNA，比如Northern印迹，微阵列分析技术，以及RT-PCR技术。但是，这些方法步骤繁琐，对检测的细胞的量要求很大，不能很好地对单个细胞进行实时检测。
[0003]目前，一些基于荧光强度的测量方法也已经被发展起来用于检测活细胞内的mRNA。其中一种方法就是纳米信标(nanoflares)。这种方法在2007年被首次提出，用于细胞内mRNA的检测，并且现在已经被广泛用于细胞内其他分子的鉴定标识以及鉴定特异性的细胞。然而，尽管荧光强度能够区分出样品的荧光基团浓度的差别，但是灵敏度有限，不能区分出荧光强度差别小的样品。与此同时，荧光强度的检测方法还会受到例如激发光强度、检测器增益、光路和样品的光损失，样品荧光基团浓度、光漂白等因素的影响，造成检测误差。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，确有必要提供一种检测稳定，不受多种因素干扰的检测方法。
[0005]—种采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法，其包括以下步骤:提供一掺有分子探针的第一培养基，所述分子探针包括修饰有荧光分子的报告DNA;将细胞置入含有第二培养基的培养皿中培养;在细胞占所述培养皿底部的60%-80%时，将该培养皿中的第二培养基吸掉，再把所述第一培养基放入该培养皿中，细胞继续培养2-6个小时后，再将该第一培养基吸掉;采用激光共聚焦显微镜对细胞成像，并采用单光子计数器测量并计算细胞内荧光分子的荧光寿命，得到荧光寿命成像图，根据该荧光寿命成像图检测细胞中的特定mRNA是否存在的ig息。
[0006]相对于现有技术，本发明提供的采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法具有以下优点:通过采用检测细胞的荧光寿命的方法检测细胞内mRNA的信息是否存在，测量稳定性强、准确度高;细胞无需特殊处理，操作简便。
【附图说明】
[0007]图1是分子探针的结构示意图及遇到革ElmRNA后的结构示意图。
[0008]图2是分子探针、报告DNA链和对照组探针进入细胞后的荧光寿命成像图。
[0009 ]图3是分子探针和对照组探针进入细胞后的荧光寿命衰减曲线。
[0010]如下具体实施例将结合上述附图进一步说明本发明。
【具体实施方式】
[0011 ]下面将结合具体实施例，对本发明提供的采用分子探针检测细胞内mRNA的方法作进一步说明。
[0012]本发明提供一种采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法，其包括以下步骤:
Si，提供一掺有分子探针的第一培养基，所述分子探针包括修饰有荧光分子的报告
DNA；
S2，将细胞置入含有第二培养基的培养皿中培养；
S3，在培养生长的细胞占所述培养皿底部面积的60%-80%时，将该培养皿中的第二培养基吸掉；
S4，把所述第一培养基放入该培养皿中，细胞继续培养2-6个小时后，再将该第一培养基吸掉；
S5，采用激光共聚焦显微镜对细胞成像，利用单光子计数器测量并计算细胞内显示的荧光寿命，得到荧光寿命成像图，根据该荧光寿命成像图检测细胞中的特定mRNA是否存在的信息。
[0013]在步骤SI中，所述分子探针包含一纳米金、识别DNA及修饰有荧光分子的报告DNA组成。具体地，所述识别DNA包覆于所述纳米金的表面，并通过识别DNA末端的巯基与纳米金相连，所述修饰有荧光分子的报告DNA与该识别DNA通过碱基互补杂交。所述第一培养基还包含L-15培养基与10%胎牛血清(FBS)的混合物。该分子探针在第一培养基中的浓度为0.5nM-2 nM。进一步，所述含有分子探针的第一培养基可通过0.2μπι的无菌醋酸过滤器过滤，以去除杂质和细菌。本实施例中，采用的识别DNA为5’-TCAAT TCAAT GTAGA CAGAC GTCTTTTGAG GTTTT TT-th1l-3’，3’端修饰巯基，用于与金连接;所采用的报告DNA为5 ’-cy5-CCTCA AAAGA CGTCT G-3’，5’端修饰cy5荧光分子;所述第一培养基为10%FBS+90%L_15，所述分子探针在第一培养基中的浓度为InM。
[0014]在步骤S2中，所述细胞为用于待检测的试验细胞，所述第二培养基为10%的胎牛血清与90%的L-15的混合物。该细胞在培养皿中培养的气相条件为100%的空气，培养温度为37°，本实施例中，所采用的细胞为乳腺癌细胞MDA-MB-231。
[0015]在步骤S3中，所述细胞在培养皿中生长，当细胞生长铺张至培养皿底部面积的60%-80%时，可利用移液枪将培养皿中的第二培养基吸掉。
[0016]在步骤S4中，当细胞在第一培养基中培养时，分子探针会不断被细胞内吞进入细胞。在一段时间内，随着培养时间的延长，进入细胞的分子探针的数量越多，后续检测荧光寿命成像时也越容易观察。当细胞在第一培养基中培养结束后，利用移液枪将培养皿中的第一培养基吸掉。
[0017]进一步，在第一培养基被吸掉后，还可包括一清洗细胞的步骤。在第一培养基被吸掉后，在细胞的膜表面可能会吸附残余的培养基和分子探针成分，为了去除残余成分，可采用缓冲液对细胞进行清洗。本实施例中，清洗细胞采用的缓冲液为0.0lM的磷酸缓冲盐溶液(PBS)0
[0018]进一步，还可包括对细胞内细胞核进行染色的步骤。对细胞核进行染色后，可利用激光共聚焦显微镜发射405nm的激发光激发DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)染料有利于在后续测量荧光寿命分布时对细胞定位和聚焦。待细胞染色后可进一步对所述细胞进行清洗，以去除杂色。本实施例中，采用DAPI染料对细胞核染色，染色时间为15分钟，并采用
0.0lM的PBS对染色后的细胞进行清洗。
[0019]在步骤S5中，在测量及计算细胞内显示的荧光寿命时，采用激发光激发细胞内报告DNA上修饰的荧光分子，并收集荧光分子发射光，根据光子的能量衰减计算荧光寿命，得到荧光寿命成像图，并根据该荧光寿命成像图得到检测细胞内的mRN