一株淡紫灰链霉菌在防治软枣猕猴桃干腐病中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一株淡紫灰链霉菌在防治软枣猕猴桃干腐病中的应用，属于农业生物
技术领域。
【背景技术】
[0002] 软率称猴桃Actinidia arguta (Sieb·et Zucc· )Planch· Ex Miq·又名软率子、 猕猴梨、藤瓜、藤梨，属于猕猴桃科，猕猴桃属大型落叶藤本。软枣猕猴桃果实较小，表面光 滑，整果可食，营养丰富，是一种新兴的商品性水果，已被加拿大、智利、法国、新西兰以及美 国等国家引进并大面积栽培。国内软枣猕猴桃商业化栽培刚刚兴起。目前，辽宁丹东栽培面 积已达10000多亩，是国内软枣猕猴桃栽培面积最大的地区。
[0003] 近两年来，丹东地区软枣猕猴桃种植园出现了一种新病害即软枣猕猴桃干腐病。 该病主要发生在春季，受害软枣猕猴桃的干基部形成深褐色的病斑，病斑向上扩大，剖开受 害组织，皮层变深褐色，韧皮部与木质部分离，韧皮部表面有白色菌丝。经鉴定，软枣猕猴桃 干腐病病原菌为拟莖点霉属真菌Diaporthe nobilis Sacc. & Speg.。该病原菌主要通过 软枣猕猴桃茎基部冻伤部位感染，导致植株韧皮部和木质部受损，影响水分、养分运输，造 成植株生长势变弱甚至萎蔫。该病危害严重，田间发病率约为20%，严重影响软枣猕猴桃产 量。
[0004] 目前该病主要采用田间管理和化学药剂防治，但效果不理想。大量使用化学农药 使病原菌产生耐药性，同时造成环境污染。利用拮抗微生物及其发酵产物对作物病害进行 生物防治能够避免环境二次污染，被认为是植物病害防治的绿色安全措施。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一株淡紫灰链霉菌在防治软枣猕猴桃干腐病中的应用，以 解决化学农药防治带来的环境污染和果实农药残留问题。
[0006] 本发明目的通过以下技术方案来实现:一株淡紫灰链霉菌在防治软枣猕猴桃干腐 病中的应用，其特征在于，一株淡紫灰链霉菌的无菌发酵滤液用于防治软枣猕猴桃干腐病。
[0007] 上述无菌发酵滤液的制备方法如下：将淡紫灰链霉菌菌株接种于液体培养基中， 培养基装量70%，发酵罐体积30L，在搅拌速度150-200rpm/min、通气量15-20%、温度25-30 °C、pH值6.5~7.5条件下，进行恒温发酵培养，发酵5天后，发酵液5000r/min离心处理，制备 上清液，上清液采用无菌滤膜过滤，制备无菌发酵滤液。
[0008] 为了检验上述无菌发酵滤液对软枣猕猴桃干腐病的防治效果，进行了盆栽试验。 结果表明：淡紫灰链霉菌无菌发酵滤液100倍稀释液采用茎部喷施和灌根处理均能达到较 好的防治效果，防效分别达86.7%、88.6%。
[0009] 上述无菌发酵滤液用于防治软枣猕猴桃干腐病的使用方法:施用时，将无菌发酵 滤液按比例1:100与水冲兑后，直接喷施于软枣猕猴桃茎部或灌于软枣猕猴桃根部。
[0010] 本发明的一株淡紫灰链霉菌已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心进行保藏，保藏编号为:CGMCC No.9972;保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，邮编100101。 保藏日期为:2014年11月14日。
[0011] 本发明的有益效果:本发明提供的一株淡紫灰链霉菌的无菌发酵滤液对软枣猕猴 桃干腐病具有较好的防治效果，为软枣猕猴桃干腐病的防治提供了一种有效、无毒、无残 留、环境友好的生物防治新途径。
【附图说明】
[0012] 图1是本发明的淡紫灰链霉菌DTJ-24基于16SrDNA序列构建的系统发育树；图2是 本发明的淡紫灰链霉菌DTJ-24对枣猕猴桃干腐病病原菌的拮抗作用。
【具体实施方式】
[0013] 以下结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。以下实施例仅用于说 明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。
[0014] 实施例1拮抗菌的分离筛选 1、分离纯化 2013年6月-2015年8月，采用五点取样法自辽宁省凤城、东港、宽甸等地采集土壤样品 50份。采集的土壤样品，自然风干。取土样IOg，置于装有90ml无菌水的三角瓶中，在摇床上 震荡20min。置30s后，依次稀释10倍，制备HT 4稀释液。微量移液器吸取HT4稀释液0.1ml至 高氏一号培养基固体平板上，无菌涂布器涂布均匀。25°C恒温培养箱倒置培养3-5天。挑取 平板上不同菌落形态的菌株转接至高氏一号培养基上获得纯培养，灭菌石蜡油封藏，4°C保 藏备用。高氏一号培养基：可溶性淀粉20.0g，硝酸钾l.Og，氯化钠 0.5g，K2 ΗΡ〇4 · 3H20 0.5g，MgS〇4 · 7H20 0.5g，FeS〇4 · 7H20 O.Olg，琼脂20.0g，水 1000ml，调整pH值到7.2。
[0015] 2、筛选 初筛：以软率猕猴桃干腐病病原菌Diaporthe nobilis为指示菌，采用平板对峙法进行 拮抗菌初筛。指示菌活化后，用直径0.6cm的无菌打孔器制备菌块。将病原菌接种于PDA平板 中央，25 °C培养24h。在距离病原菌3cm处对称接种待测菌株，以不接待测菌株为对照，每个 处理重复3次。置于25°C培养箱中培养，至对照长满整个平板，测量抑菌带宽度，挑选抑菌较 明显的菌株进行复筛（图I ) ADA培养基：马铃薯200 . Og，葡萄糖10 . Og，琼脂20 . Og，水 1000ml，自然pH。
[0016] 复筛：以软枣猕猴桃干腐病病原菌Diaporthe nobilis为指示菌，采用发酵液生长 速率法进行拮抗菌复筛：初筛获得的拮抗菌接种于高氏一号液体培养基中，25°C、转速 160r/min，恒温振荡器中培养3天，发酵液离心去菌体，无菌滤膜过滤后滤液备用。取滤液 IOml与90ml冷却至60°C的HM混合均匀后倒平板，用直径0.6cm打孔器制备病原菌菌块，接 种于培养皿中心，以无菌水处理为对照。每个处理重复3次，25°C培养至对照菌落长满整个 平板，测量处理菌落直径，求出抑菌率。筛选出对软枣猕猴桃干腐病病原菌Diaporthe nobilis具有较强拮抗作用的菌株DTJ-24,其抑菌率达85.1%。
[0017] 实施例2拮抗菌株的鉴定 1、形态学鉴定及生化特征 菌落形态:菌株DTJ-24在高氏一号培养基上气生菌丝紫丁香色、基内菌丝无色，无可溶 色素；显微形态:在显微镜下基内菌丝无隔膜，不断裂;气生菌丝多分枝，且分枝较短，孢子 丝长，螺旋形，孢子椭圆形至柱形，表面光滑。
[0018] 生化特征:菌株DTJ-24能够使明胶液化，淀粉水解弱。产生硫化氢、能分解纤维素、 牛奶胨化、不凝固。可以利用葡萄糖、果糖，不利用蔗糖、肌醇、甘露醇，棉子糖、D-木糖。
[0019] 2、16SrDNA 序列分析 将菌株DTJ-24接种于高氏一号液体培养基，25 °C摇床培养3d，离心收集菌体。采用生工 生物工程(上海)有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒提取该菌株的基因组D