穿心莲内酯在治疗骨关节退行性病变药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学领域，具体地涉及穿心莲内酯对白介素-liKlL-Ιβ)诱导软骨细胞的保护作用及以穿心莲内酯为原料在制备治疗骨关节退行性病变药物中的应用。
【背景技术】
[0002]骨关节退行性病变是临床亟待解决的一个难题，临床上由于创伤和各种疾病如骨关节炎、骨坏死等造成骨关节退行性病变很常见。骨关节退行性病变治疗已成为近年来骨科及相关领域基础和临床研究的热点和难点。目前研究表明，多种生长因子在骨关节退行性病变的治疗中发挥重要作用，包括TGF-131、IGF-l、FGF等。但是目前常用的生长因子存在提取工艺复杂、价格昂贵、容易降解等诸多弊端，不利于广泛的临床应用。由于关节软骨细胞是软骨中唯一的细胞成分，而关节软骨细胞是软骨基质合成及组织功能代谢的平衡的关键，可见关节软骨细胞对关节软骨的重要性。因此，急需开发和寻找更易提取，成本低廉，同时具有保护软骨细胞、改善软骨代谢、维持软骨完整性作用的药物用于改善骨关节退行性病变。
[0003]穿心莲(Andrographispaniculata (Burm.f) Ness)又名春莲秋柳、苦胆草、金耳钩等，是爵床科穿心莲属植物，是广西壮族民间止痛消炎常用草药。其主要活性成分穿心莲内酯(Andrographolide, AD)具有祛热解毒，消炎止痛之功效，对骨关节退行性病变的作用尚无报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种改善骨关节退行性病变的安全有效、价格低廉、能推广应用的药品。
[0005]为完成以上目的，本发明采用以下技术方案:
一、穿心莲内酯的制备
提取方法:干燥的穿心莲叶1kg粉碎后，用10L的75%乙醇冷浸，得到浸出液用活性炭回流脱色，趁热抽滤。回收乙醇，缓慢加水，放置析晶，抽滤，得到粗结晶物。粗结晶物用少量水洗涤，95%乙醇加热溶解，1%活性炭回流30min，过滤，滤液放置析晶，抽滤，得到白色粗结晶201.54g。
[0006]纯化方法:将白色粗结晶溶解于甲醇，上样于中性氧化铝柱。以乙酸乙酯-甲醇-水不同比例即25:0.1:0;12:0.4:0;0:1:0;0:5:5;0:3.5:6.5进行梯度洗脱。薄层色谱跟踪，合并相似馏分。合并用0:3.5:6.5乙酸乙酯-甲醇-水洗脱的馏分，回收洗脱剂，得白色结晶48.24mg0
[0007]二、穿心莲内酯对体外IL-1iH秀导软骨细胞的保护
(I)软骨细胞的提取:无菌条件下，从新西兰乳兔的四肢骨头的骨骺端分离出软骨组织，用胰酶消化0.5h，缓冲液(PBS)洗后加入二型胶原酶消化3h，将上清液转入离心管1000r/min离心5min，加入含有15%胎牛血清(FBS)、1%青链霉素的高糖DMEM培养基重悬，细胞培养放入37°C、5% CO2及湿度饱和的培养箱中培养，每2?3天换一次液;细胞生长至90%融合度时，用胰酶消化进行传代，扩增至所需要的细胞数量。
[0008](2)细胞毒性试验:选用生长状态良好的第一代兔关节软骨细胞，PBS冲洗一遍，胰酶消化收集细胞，计数后接种于96孔板中，每孔细胞量为5X 13个。待细胞贴壁后，将孔内液体吸掉，加入含不同浓度穿心莲内酯(O?50mM)的高糖DMEM培养基，每个浓度重复6个复孔。培养三天后，每孔加入20yL的噻唑蓝(MTT)，培养箱孵育4h，弃上清液，每孔加入DMSO200yL，570nm测吸收值。筛选出适宜浓度的穿心莲内酯，用于下一步实验。
[0009](3)第一代细胞消化计数后，接种于24和6孔板中，每孔细胞量分别为2X 104、1 X15个。细胞贴壁后，加入含有穿心莲内酯的高糖DMEM完全培养基，Ih后加入10ng/mL IL-Ιβ诱导24h，通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real time- PCR)法检测相关基因表达，免疫组织化学法检测相关蛋白的表达，从而鉴定穿心莲内酯对IL-1iH秀导软骨细胞的保护作用。
[0010]三、穿心莲内酯在改善骨关节退行性病变的应用
对新西兰兔后肢膝关节行前后交叉韧带剪断术，形成骨关节退行性病变模型，通过关节腔内直接注射穿心莲内酯，观察其对骨关节退行性病变的作用。取兔子双侧膝关节，肉眼观察是否有赘肉及关节软骨面溃疡形成，解剖显微镜下对股骨踝关节软骨表面进行观察，并按PelIetier大体评分标准对关节软骨进行评分。结果显示关节腔内直接注射穿心莲内酯，能明显改善骨关节退行性病变。
[0011 ]通过qRT-PCR检测基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases , MMPs)基因表达，结果显示穿心莲内酯能明显降低MMPs表达，包括MMP-1、MMP-3及MMP-13基因及蛋白的表达水平，显著提高组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metal loproteinases ,Timp-1)基因及蛋白的表达，提示穿心莲内酯具有对抗关节软骨基质降解的作用，从而保护骨关节软骨的完整性。
[0012]本发明的优点:
本发明首次研究穿心莲内酯对骨关节退行性病变的作用，实验表明，穿心莲内酯可作用于骨关节退行性病变的多个环节或多个靶点，有效地抑制关节软骨基质降解、保护软骨细胞的功能完整、抑制关节软骨退行性变化，最终促进骨关节退行性病变的修复。穿心莲内酯关节腔内直接注射，对改善骨关节退行性病变具有更好更直接的作用，是骨关节退行性病变的一种具有潜在价值的新药。
【附图说明】
[0013]图1，MTT检测穿心莲内酯对软骨细胞毒性试验结果(n=5，与ΟμΜ比较*p〈0.05，#ρ<0.01, ***ρ〈0.001，)。图2，qRT-PCR检测穿心莲内酯对体外IL-1m秀导的软骨细胞Timp-
1、ΜΜΡ-1、ΜΜΡ-3及丽?-13基因表达结果(11=6，(:011壮01组表示空白对照组；几-10组表示加入10ng/mL的IL-Ιβ; Cl组表示加入I.56 μΜ穿心莲内酯及10ng/mL IL-Ιβ; C2组表示加入3.125μΜ穿心莲内酯及10ng/mL IL_10;C3组表示加入6.25μΜ穿心莲内酯及10ng/mL IL-Ιβ;同一时间点，与Control组比较*ρ〈0.05，** ρ<0.01, ***ρ〈0.001)。图3，免疫组织化学检测穿心莲内酯对体外IL-1iH秀导的软骨细胞MMP-1及Timp-1蛋白表达检测结果(Control组表示空白对照组；几-1摊且表示加入10呢/1^的11^-1|3;(:1组表示加入1.56 μΜ穿心莲内酯及1ng/mL 11^-10<2组表示加入3.125 μΜ穿心莲内酯及10ng/mL IL_10;C3组表示加入6.25μΜ穿心莲内酯及lOng/mL IL-Ιβ)。图4，股骨課关节软骨大体观察结果(Group A:假手术组，GroupB:模型组，Group C:穿心莲内酯组)。图5，股骨課关节软骨大体评分结果(n=8,Group A:假手术组，Group B:模型组，Group C:穿心莲内酯组，同一时间点，与Group A比较*ρ〈0.05,** ρ<0.01, ***ρ〈0.001)。图6，qRT-PCR检测穿心莲内酯对骨关节退行性病变相关基因MMP-1、匪？-3、丽？-13及1111^)-1表达结果(11=8，61'0即 A:假手术组，Group B:模型组，GroupC:穿心莲内酯组，同一时间点，与Group A比较*ρ〈0.05, ** ρ<0.01, ***ρ〈0.001)ο
【具体实施方式】
[0014]一、穿心莲内酯的制备
提取方法:干燥的穿心莲叶1kg粉碎后，用100L的75%乙醇冷浸，得到浸出液用活性炭回流脱色，趁热抽滤。回收乙醇，缓慢加水，放置析晶，抽滤，得到粗结晶物。粗结晶物用少量水洗涤，95%乙醇加热溶解，1%活性炭回流30min，过滤，滤液放置析晶，抽滤，得到白色粗结晶201.54g。
[0015]纯化方法:将白色粗结晶溶解于甲醇，上样于中性氧化铝柱。以乙酸乙酯-甲醇-水不同比例即25:0.1:0;12:0.4:0;0:1:0;0:5:5;0:3.5:6.5进行梯度洗脱。薄层色谱跟踪，合并相似馏分。合并用0:3.5:6.5乙酸乙酯-甲醇-水洗脱的馏分，回收洗脱剂，得白色结晶48.24mg0
[0016]二、穿心莲内酯对体外IL-1m秀导软骨细胞的保护
(I)软骨细胞的提取:无菌条件下，从新西兰乳兔的四肢骨头的骨骺端分离出软骨组织，用胰酶消化0.5h，缓冲液(PBS)洗后加入二型胶原酶消化3h