一种苹果茎沟病毒检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物检测领域，具体地说，本发明涉及一种苹果茎沟病毒检测试剂 盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 苹果为世界四大水果之一，分布广泛，具有很高的经济价值，在我国已有两千多年 的栽培历史。目前，我国苹果树栽培面积和总产量均居世界第一，但生产水平和果品质量仍 与先进国家存在相当差距，其影响因素很多，病毒病的危害是造成这一现象的重要原因之 一。苹果病毒病在世界各地广泛分布，影响严重，具有危害性强、传播扩散快和难以治愈的 特点。树体受到病毒危害后，病毒在寄主细胞内寄生并增殖，破坏干扰树体的正常生理机 能，严重影响果树的生长，降低产量、品质、果品的耐贮藏性和耐运力，也影响苹果根系对土 壤营养物质的吸收和利用，造成严重的经济损失。
[0003] 苹果莖沟病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)是常见的潜隐性病毒之一，危 害苹果、梨、柑橘、樱桃、杏等果树，可通过种子、嫁接、机械接种、汁液摩擦等方式感染宿主， 迄今尚未发现其传播媒介。被苹果茎沟病毒侵染的果树植株表现出嫁接部位坏死，叶片不 同程度变黄，后期出现大块黑斑或卷叶等症状，病株较健康株生长矮小并衰弱。由于其症状 与其他常见病毒感染相比并无典型性，因此容易被忽视。
[0004] 苹果茎沟病毒是发形病毒属(Capillovirus)的代表性成员，其基因组有两个0RF: 0RF1编码分子量241KDa的多聚蛋白，CP位于其C端，大小为27KDa; 0RF2位于0RF1内部，编码 分子量为36KDa的运动蛋白，运动蛋白与外壳蛋白部分基因重叠。目前对苹果茎沟病毒的检 测，多采用传统生物学方法、血清学方法以及分子生物学方法。然而，传统方法耗时长，灵敏 度不高，特异性差;血清学方法费用昂贵，操作步骤多，耗时较长，且样品中可能存在与抗体 发生非特异性反应的杂质，易出现假阳性结果，因此只适合于初筛;而分子生物学方法由于 其特异性强、灵敏度高，是现今应用最多的处于研究前沿的方法。为了适应产业发展需求， 有必要开发一种能够更加快速、准确地对苹果茎沟病毒进行分子生物学检测的方法。
[0005] 环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近些 年发展起来的一种新型的核酸扩增方法（见文献Notomi T，0kayama H，Masubuchi Η, Yonekawa T,ffatanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000Jun 15;28(12):E63)。而逆转录-环介导恒温扩增技术 (RT-LAMP)是基于LAMP建立的RNA检测技术，其灵敏度是普通RT-PCR的100倍。RT-LAMP扩增 原理与LAMP相同，但在反应体系中增加了逆转录酶，使RNA的逆转录和cDNA的LAMP扩增在同 一试管中一步完成。与常规PCR相比，RT-LAMP无需模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观 察等过程，短时间内即可实现大量拷贝数的核酸扩增，且无需高端的仪器设备，具有特异性 强、灵敏度高、易于判读、可定性定量等优势。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种苹果茎沟病毒检测试剂盒及检测方法。
[0007] 为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供了一种苹果茎沟病毒检测试 剂盒，其特征在于包括4条特异性引物:外引物F3，其序列如SEQ ID NO: 1所示;外引物B3，其 序列如SEQ ID N0:2所示；内引物FIP，其序列如SEQ ID N0:3所示；内引物BIP，其序列如SEQ ID N0:4所示。引物序列具体如下：
[0008] 外引物F3:TGTTCCTGAATTGAAAACCTT(SEQ ID N0:1)
[0009] 外引物B3:CAAAGTCAAATGCAACCCA(SEQ ID N0:2)
[0010] 内引物FIP:TCGGCAAAAGGCTCACAAAG-TACTTCTAGGCAAAATTCTTTGAAC(SEQ ID N0:3)
[0011] 内引物BIP:CTGGCACGTGAATTTCTTCATGA-TTCTCAAATGCTTTGGGC(SEQ ID N0:4)。
[0012] 优选所述外引物F3和B3的浓度均为5pm〇lAU，所述内引物FIP和BIP的浓度均为 40ρηιο1/μ1 〇
[0013] 进一步地，本发明的试剂盒还可以包括反应缓冲液、AMV逆转录酶、Bst DNA聚合酶 和核酸染料，其中所述反应缓冲液由10mM (1阶？、10\1116^11〇?〇1反应缓冲液、511^甜菜碱和 50mM MgS〇4组成。
[0014] 优选所述核酸染料为SYBR Green I。
[0015] 进一步地，本发明的试剂盒还可以包括RNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照。
[0016] 在另一个方面中，本发明还提供了一种苹果茎沟病毒检测方法，其利用RT-LAMP技 术，包括以下步骤：
[0017] (1)提取待测样品RNA;
[0018] (2)设计并合成引物；
[0019] (3)建立25μ1的RT-LAMP反应体系，其包括5ρ??〇1/μ1的外引物F3 1μ1、5ρ??〇1/μ1的 外引物Β3 1μ1、40ρπιο1/μ1的内引物FIP 1μ1、40ρπιο1/μ1的内引物ΒΙΡ ΙμL、反应缓冲液2.5μ 1、2U AMV逆转录酶lyl、8U Bst DNA聚合酶ΙμL、模板DNA 2μ1，加水补充至25μ1，并以苹果茎 沟病毒基因组DNA作为阳性对照，以100mM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作为阴性对照；
[0020] (4) LAMP反应:将步骤(3)中PCR管于63 °C恒温反应60min;
[0021] (5)分析判断反应产物结果:在(4)中所得反应产物中加入ΙμL核酸染料，根据反应 液的颜色判断是否存在苹果茎沟病毒。
[0022]在本发明的检测方法中，所述外引物F3的序列如SEQ ID NO: 1所示，外引物Β3的序 列如SEQ ID N0:2所示，内引物FIP的序列如SEQ ID N0:3所示，内引物BIP的序列如SEQ ID NO: 4所示。
[0023] 优选所述反应缓冲液由l〇mM (1犯1\10\1116這〇?〇1反应缓冲液、51111甜菜碱和5〇111]\1 MgS〇4组成。
[0024]优选所述核酸染料为SYBR Green I，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，待测 样品中不含ASGV;如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性，待测样品中含有ASGV。
[0025]本发明的苹果茎沟病毒检测试剂盒和检测方法利用RT-LAMP技术，针对ASGV的CP 区域设计4条特异性引物，其识别ASGV的6个特定区域，特异性和灵敏度更高。反应在等温 (63°C)条件下进行，不需要循环仪等昂贵的仪器，一步完成逆转录和扩增步骤，假阳性率 低、快速、高