检测人HSP90α-2蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于多肽化学和免疫学领域，具体涉及人热休克蛋白90 α -2 (HSP90a -2) 抗原表位肽、用该抗原表位肽制备的HSP90 a -2特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆 抗体、所述抗体在制备人HSP90 a -2体外诊断试剂盒上的应用，人HSP90 a -2体外诊断试 剂盒，以及一种用于定量检测待测物中人HSP90 a -2蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 近年来，对肿瘤标志物的研究已经引起许多研究者的注意，寻找一种可靠的、非侵 入式的、能反映肿瘤的发生、增殖分化的肿瘤标志物是众多研究者的共同心愿。通过对血 液、组织液的研究，目前发现一些肿瘤标志物可以对肿瘤的发生、增殖分化进行预测。其中， 人热休克蛋白90 a -2 (HSP90 a -2)就是这样的一种肿瘤标志物。
[0003] 热休克蛋白90 a-2是热休克蛋白家族中的重要的蛋白之一，其作为分子伴侣来 参与调控、维持细胞内多种蛋白的构象和功能，在调节细胞生长、分化和凋亡等方面发挥重 要的作用。近年发现，热休克蛋白90 a-2作为伴侣蛋白对肿瘤的恶性转变、生长、增殖及 侵袭有着重要的作用。有许多报道证实，人体肿瘤组织中，热休克蛋白的表达发生了改变。 在不同部位的肿瘤组织中，热休克蛋白表达的改变并不一致。目前发现肿瘤病人血清中的 HSP90 a -2含量与肿瘤的恶性程度，尤其是转移正相关。因此，HSP90 a -2有希望作为肿瘤 诊断和预后的标志物。
[0004] 检测血清中的HSP90 a -2水平的最理想的方法为免疫检测。因此，寻找合适的具 有免疫原性的HSP90 a -2抗原表位肽、制备特异性的HSP90 a -2抗原及抗体即成了重点。
[0005] 荧光免疫层析方法测血液中的待测物操作简便、快速，只需10分钟就能完成样品 检测，并且检测范围宽，灵敏度好，能够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。中国专利申 请No. 200910117820. 8公开了一种荧光微球免疫层析试纸条的制备方法及定量检测方法； 中国专利申请No. 200910047352. 1公开了一种荧光免疫层析试纸及其制备方法和应用。然 而，目前还没有针对人HSP90 a -2蛋白的荧光免疫层析试纸。
【发明内容】
[0006] 为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种用于定量检测待测物中 人HSP90 a -2蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法。
[0007] 具体而言，本发明提供了：
[0008] -种用于定量检测待测物中人HSP90 a -2蛋白的荧光免疫层析试纸，该试纸通过 双抗体夹心法检测所述人HSP90 a -2蛋白，其中：
[0009] 所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一 HSP90 a -2单克隆抗体作为捕获 抗体，所述第一 HSP90 a -2单克隆抗体来源于人HSP90 a -2抗原表位肽（1)和（2)中的一 者；并且
[0010] 所述双抗体夹心法采用第二HSP90 α -2单克隆抗体作为检测抗体，所述第二 HSP90 a -2单克隆抗体来源于人HSP90 a -2抗原表位肽（1)和（2)中的另一者；
[0011] 所述人HSP90 a -2抗原表位肽⑴和⑵分别为：
[0012] (l)Tyr-Glu-Lys-Glu-Ser-Glu-Asp-Lys-Pro-Glu-Ile-Glu-Asp-Val-G ly-Ser-Asp-Glu ；
[0013] (2) Tyr-Arg-Gly-11 e-Asp-Glu-Asp-Asp-Pr〇-Thr-Ala-Asp-Asp-Thr-Se r_A1a_A1a_Va1-Thr_G1u 〇
[0014] 优选地，所述第一 HSP90 a -2单克隆抗体是由第一 HSP90 a -2抗原制备而成的，该 第一 HSP90 a -2抗原是通过使所述人HSP90 a -2抗原表位肽（1)和（2)中的一者与载体蛋 白偶联制备而成的；并且
[0015] 所述第二HSP90 a -2单克隆抗体是由第二HSP90 a -2抗原制备而成的，该第二 HSP90 a-2抗原是通过使所述人HSP90 a-2抗原表位肽（1)和（2)中的另一者与载体蛋白 偶联制备而成的。
[0016] 优选地，所述突光微球的粒径为320nm至400nm。
[0017] 优选地，所述荧光微球上的荧光物质为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异 硫氰酸罗丹明或X-罗丹明等，其中优选为X-罗丹明；所述荧光微球的微球材料为聚苯乙 烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚物。
[0018] 优选地，所述突光微球的激发波长为350~600nm，优选为390nm ;发射波长为 500 ~700nm，优选为 615nm。
[0019] 优选地，所述荧光免疫层析试纸具有底板，并且在该底板上沿使用时的层析方向 依次以接触方式设置有：样品垫、结合垫、反应膜、吸水滤纸，所述结合垫设置有所述的标记 有荧光微球的第一 HSP90 a -2单克隆抗体，所述反应膜包括检测区和质控区，所述检测区 包被有所述第二HSP90 a -2单克隆抗体，所述质控区包被有能与所述的标记有荧光微球的 第一 HSP90 a -2单克隆抗体特异性结合的抗抗体。
[0020] 优选地，所述反应膜为在大于550nm的波长下基本上不发荧光的硝酸纤维素膜。
[0021] 优选地，所述底板基本上不具有荧光性质。
[0022] 优选地，所述抗抗体为羊抗鼠 IgG单克隆抗体或兔抗鼠 IgG单克隆抗体，其中优选 为羊抗鼠 IgG单克隆抗体。
[0023] 本发明还提供了一种制备所述的用于定量检测待测物中人HSP90 a-2蛋白的荧 光免疫层析试纸的方法，其包括以下步骤：
[0024] 1)提供标记有荧光微球的第一 HSP90 a -2单克隆抗体；
[0025] 2)提供结合垫，其中在所述结合垫上包被所述的标记有荧光微球的第一 HSP90 a -2单克隆抗体；
[0026] 3)提供反应膜，其中在所述反应膜上沿使用时的层析方向间隔固定第二 HSP90 a -2单克隆抗体和抗抗体，以分别形成检测区和质控区；
[0027] 4)在底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置样品垫、所述结合垫、所述 反应膜、吸水滤纸，从而制成所述荧光免疫层析试纸。
[0028] 优选地，所述步骤1)包括：
[0029] a)用碳二亚胺活化荧光微球，优选地，将荧光微球的水分散液或MES缓冲液分散 液经超声波处理并与碳二亚胺混合，从而活化所述荧光微球；
[0030] b)洗涤步骤a)所获得的活化的荧光微球，优选地，将步骤a)所获得的活化的荧光 微球用N-羟基硫代琥珀酰亚胺-柠檬酸缓冲液洗涤、分散，并经超声波处理；
[0031] c)用步骤b)所获得的荧光微球标记第一 HSP90 a-2单克隆抗体，优选地，将步骤 b)所获得的荧光微球与第一HSP90 a -2单克隆抗体混合，用BSA-乙醇胺缓冲液封闭，离心， 用BSA-吐温水溶液分散，经超声波处理，从而得到标记有荧光微球的第一 HSP90 a -2单克 隆抗体。
[0032] 优选地，在所述步骤2)中，所述的标记有荧光微球的第一 HSP90 a -2单克隆抗体 的包被浓度为〇. 5~2mg/ml。
[0033] 优选地，在所述步骤3)中，所述检测区和所述质控区间隔3mm至8mm。
[0034] 优选地，在所述步骤3)中，所述第二HSP90 a -2单克隆抗体和所述抗抗体的包被 浓度分别为〇. 5~2mg/ml。
[0035] 本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
[0036] 1.本发明的人HSP90 a -2抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原（免疫 原）免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。
[0037] 2.用本发明制备的HSP90 a -2单克隆抗体和多克隆抗体能够高度特异地与血液 样本中的HSP90 a -2结合。
[0038] 3.本发明的人HSP90 a -2体外诊断试剂盒可以有效地检测血清中的HSP90 a -2的 水平，可用来判断肿瘤的恶性程度，并对转移和预后进行预测。
[0039] 4.本发明将荧光分析技术与快速层析免疫技术相结合，提供了一种用于定量检测 待测物中人HSP90 a -2蛋白的荧光免疫层析试纸，用该试纸检测待测物中的人HSP90 a -2 蛋白，操作简便、快速，只需10分钟就能完成样品检测，并且检测范围宽、特异性高、灵敏度 好，能够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。
[0040] 5.本发明在制备所述人HSP90 a -2蛋白的荧光免疫层析试纸的过程中，通过大量 的试验摸索，优化了各方面的制备条件，使得用本发明的荧光免疫层析试纸进行检测时，荧 光信背比大大提高，从而提高了检测灵敏度和结果可信度；此外，本发明还通过试纸的检测 区与质控区的荧光强度比值的变化来反应样品中HSP90 a -2的含量，这与传统的层析技术 只考查检测区的绝对荧光强度相比，最大程度上减少了外界条件和背景等的影响，进一步 提高了检测结果可信度。
【附图说明】
[0041] 图1示意性示出本发明的一个实施方案的荧光免疫层析试纸的结构示意图。
【具体实施方式】
[0042] 以下通过【具体实施方式】的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对 本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只 要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
[0043] 一、人HSP90 a -2抗原表位肽
[0044] 本文中所述的人HSP90 a -2蛋白是本领域已知的，其氨基酸序列是本领域已知 的，可以在NCBI等专业数据库中查到。
[0045] 本发明提供了人HSP9〇a-2抗原表位肽（1)和（2)，其氨基酸序列分别如序列表 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示，为：
[0046] (l)Y-E-K-E-S-E-D-K-P-E-I-E-D-V-G-S-D-E ;和
[0047] (2)Y-R-G-I-D-E-D-D-P-T-A-D-D-T-S-A-A-V-T-E。
[0048] 本发明的发明人经过大量的理论研究和实验摸索，最终筛选得到两种具有良好的 抗原性的抗原表位肽。
[0049] HSP90 α -2 抗原表位肽（1)包含人 HSP90 α -2 蛋白（NCBI 登录号 ΝΡ_005339· 3)N 端第249位至第265位的肽段，并且在该肽段的N段加上Y，从而构成包含18个氨基酸的 HSP90 α -2抗原表位肽（1)。
[0050] HSP90 α -2 抗原表位肽（2)包含人 HSP90 α -2 蛋白（NCBI 登录号 NP_005339. 3)C 端第697位至第714位肽段，并且在该肽段的N段加上Y和R，从而构成包含20个氨基酸的 HSP90 α -2抗原表位肽（2)。
[0051] 这两个肽段均具有亲水性、抗原性强并且易于合成的特点。
[0052] 目前，本发明研究发现，本发明的HSP90 α -2抗原表位肽具有如下功能：
[0053] 1.具有抗原性；2.与载体蛋白连接后作为免疫原刺激动物产生特异性的抗体； 3.用抗原表位肽制备的抗体可特异性地与人HSP90 α -2结合。
[0054] 本发明的HSP90 α -2抗原表位肽的制备方法可用化学合成法：利用美国ΑΒΙ431Α 型多肽自动合成仪，通过固相法合成抗原表位肽。本发明的抗原表位肽（1)和（2)的分子 量分