本发明涉及一种用于提高孵化率的脱壳卤虫卵的制备方法，属于卤虫卵技术领域。
背景技术：
卤虫又叫丰年虫，是世界性分布的小型甲壳虫，生活于盐湖、盐场等高盐水域中。卤虫卵是优质的水产鱼苗饵料，在水产养殖业具有重要作用。卤虫卵是含铁脂蛋白，鱼虾幼苗无法消化，因此一般需要先孵化出卤虫幼体，然后再将幼体作为饵料投喂。孵化后的卵壳和幼体不易彻底分离，易造成部分已孵化幼体随壳倒掉而损耗或卵壳和幼体一起被采食导致鱼虾幼苗肠梗阻死而亡。卤虫卵去壳后可以直接投喂，也可以孵化出幼体。由于没有卵壳，可以减少幼体破壳时大的能量消耗，有利于保留更多营养。在鱼虾育苗中，卤虫卵的费用往往占育苗场50～70%成本。通过去壳的方式，可以提高孵化率并使卤虫幼体保留更多营养，同时还可以利用大量孵化率低的低质卵，降低育苗成本，对育苗场意义重大。
目前卤虫卵去壳多采用化学法，即用次氯酸钠及氢氧化钠溶液溶解卵壳，去壳后反应无法立刻终止，需要将去壳卵捞出清洗除去余氯，此过程中溶液的余氯继续对脱壳卵作用，损伤较大；同时在去壳过程中溶液温度容易升高，影响孵化率，需要采取降温措施；操作过程对孵化率影响较大，工艺不稳定；且卵表面余氯难以彻底去除，投喂时有氯特有气味影响水产幼苗采食，往往还需要添加诱食剂。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题：针对现有的卤虫卵去壳时多采用化学法，去壳后反应无法立刻终止，去壳卵表面的余氯继续对脱壳卵作用，使脱壳卵卵膜损伤较大，并且去壳时溶液温度升高，影响孵化率的问题，提供了一种有机酸软化卵壳，生物酶和胆汁复配分解、溶解卵壳使卤虫卵脱壳来制备脱壳卤虫卵的方法，本发明首先以山楂为原料进行榨汁，将含有有机酸的山楂汁与淡盐水对卤虫卵进行水合，再用胆汁和磷脂酶C配合使卤虫卵壳中的磷脂和胆固醇分解，然后再用皱褶假丝酵母菌及其分泌的脂蛋白脂酶、活性物质与木瓜蛋白酶配合使卤虫卵脱壳，并且去壳卵卵膜对木瓜蛋白酶和脂蛋白脂酶的抗性强，可不使用专门的抑制剂即可终止反应，即可得到脱壳卤虫卵，本发明得到的脱壳卤虫卵在进行孵化时孵化率大幅度提高，达到了93～96%，并且本发明去壳效果稳定，操作难度低。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
（1）称取100～150g未成熟的山楂，经人工去籽后，用去离子水清洗3～5次，将洗净的山楂和500～600mL去离子水一同置于榨汁机中进行榨汁，得到山楂汁；
（2）称取100～200g卤虫卵加入到烧杯中，再加入300～400mL质量分数为8%氯化钠溶液和200～300mL上述山楂汁，曝气处理3～4h，使卤虫卵充分吸水膨胀，再用纱布过滤，收集卤虫卵，得到预处理卤虫卵；
（3）取300～400g新鲜猪胆汁和2～4g磷脂酶C加入到盛有300～400mL去离子水的烧杯中，搅拌混合3～5min后，再加入上述预处理卤虫卵，并通入空气，控制气流量为50～70m3/（m2·min），浸泡处理30～40min，使卤虫卵壳中的磷脂和胆固醇分解，再用纱布过滤，收集卤虫卵，备用；
（4）按重量份数计，称取10～20份橄榄油，20～30份蛋白胨，8～12份酵母粉，0.3～0.5份磷酸氢二钾，0.1～0.3份硫酸镁和600～700份去离子水，加入到培养皿中，搅拌混合3～5min后，置于灭菌箱中，在90～100℃下灭菌5～10min，得到发酵培养基；
（5）将上述发酵培养基转移至发酵罐中，再按6～8%的接种量将皱褶假丝酵母菌接种到发酵罐中，在25～30℃下发酵2～3天后，再加入步骤（3）备用的卤虫卵和0.3～0.5g木瓜蛋白酶，并通入空气，好氧发酵3～4h，发酵结束，收集发酵罐内的物料，并用纱布过滤，收集滤渣，并用去离子水洗涤3～5次后，再用去离子水洗去脱壳卵表面的酶和菌，得到脱壳卤虫卵。
本发明的应用方法：首先将玻璃钢孵化桶用质量分数为75%无水乙醇溶液进行消毒，静待10～15min后，向孵化桶内加入20～25L质量分数为5%氯化钠溶液，并通入空气，控制气流量为50～70m3/（m2·min），随后将氯化钠溶液质量10～15%的脱壳卤虫卵倒入孵化桶中，控制孵化桶内温度在28～32℃，孵化24～26h，待卤虫完全孵化后，停止通气，静置3～5min后，打开孵化桶底阀，将沉卵和杂质放出后，将桶内剩余物质过滤，弃去溶液，收集滤渣，将滤渣用去离子水清洗3～5次后，得到卤虫无节幼体。经检测，本发明得到的脱壳卤虫卵在进行孵化时孵化率大幅度提高，达到了93～96%，比用次氯酸钠脱壳后的卤虫卵孵化率提高了15～20%，并且本发明去壳效果稳定，操作难度低。
本发明与其他方法相比，有益技术效果是：
（1）本发明属于生物法去壳，所用原料为天然物质，不引入化学原料，对去壳卵无化学污染且对去壳卵卵膜损伤小，对后续孵化无影响，并且去壳效果稳定；
（2）本发明得到的脱壳卤虫卵在进行孵化时孵化率大幅度提高，达到了93～96%，本发明操作步骤简单，所需成本低。
具体实施方式
首先称取100～150g未成熟的山楂，经人工去籽后，用去离子水清洗3～5次，将洗净的山楂和500～600mL去离子水一同置于榨汁机中进行榨汁，得到山楂汁；称取100～200g卤虫卵加入到烧杯中，再加入300～400mL质量分数为8%氯化钠溶液和200～300mL上述山楂汁，曝气处理3～4h，使卤虫卵充分吸水膨胀，再用纱布过滤，收集卤虫卵，得到预处理卤虫卵；然后取300～400g新鲜猪胆汁和2～4g磷脂酶C加入到盛有300～400mL去离子水的烧杯中，搅拌混合3～5min后，再加入上述预处理卤虫卵，并通入空气，控制气流量为50～70m3/（m2·min），浸泡处理30～40min，使卤虫卵壳中的磷脂和胆固醇分解，再用纱布过滤，收集卤虫卵，备用；再按重量份数计，称取10～20份橄榄油，20～30份蛋白胨，8～12份酵母粉，0.3～0.5份磷酸氢二钾，0.1～0.3份硫酸镁和600～700份去离子水，加入到培养皿中，搅拌混合3～5min后，置于灭菌箱中，在90～100℃下灭菌5～10min，得到发酵培养基；将上述发酵培养基转移至发酵罐中，再按6～8%的接种量将皱褶假丝酵母菌接种到发酵罐中，在25～30℃下发酵2～3天后，再加入备用的卤虫卵和0.3～0.5g木瓜蛋白酶，并通入空气，好氧发酵3～4h，发酵结束，收集发酵罐内的物料，并用纱布过滤，收集滤渣，并用去离子水洗涤3～5次后，再用去离子水洗去脱壳卵表面的酶和菌，得到脱壳卤虫卵。
实施例1
首先称取100g未成熟的山楂，经人工去籽后，用去离子水清洗3次，将洗净的山楂和500mL去离子水一同置于榨汁机中进行榨汁，得到山楂汁；称取100g卤虫卵加入到烧杯中，再加入300mL质量分数为8%氯化钠溶液和200mL上述山楂汁，曝气处理3h，使卤虫卵充分吸水膨胀，再用纱布过滤，收集卤虫卵，得到预处理卤虫卵；然后取300g新鲜猪胆汁和2g磷脂酶C加入到盛有300mL去离子水的烧杯中，搅拌混合3min后，再加入上述预处理卤虫卵，并通入空气，控制气流量为50m3/（m2·min），浸泡处理30min，使卤虫卵壳中的磷脂和胆固醇分解，再用纱布过滤，收集卤虫卵，备用；再按重量份数计，称取10份橄榄油，20份蛋白胨，8份酵母粉，0.3份磷酸氢二钾，0.1份硫酸镁和600份去离子水，加入到培养皿中，搅拌混合3min后，置于灭菌箱中，在90℃下灭菌5min，得到发酵培养基；将上述发酵培养基转移至发酵罐中，再按6%的接种量将皱褶假丝酵母菌接种到发酵罐中，在25℃下发酵2天后，再加入备用的卤虫卵和0.3g木瓜蛋白酶，并通入空气，好氧发酵3h，发酵结束，收集发酵罐内的物料，并用纱布过滤，收集滤渣，并用去离子水洗涤3次后，再用去离子水洗去脱壳卵表面的酶和菌，得到脱壳卤虫卵。
首先将玻璃钢孵化桶用质量分数为75%无水乙醇溶液进行消毒，静待10min后，向孵化桶内加入20L质量分数为5%氯化钠溶液，并通入空气，控制气流量为50m3/（m2·min），随后将氯化钠溶液质量10%的脱壳卤虫卵倒入孵化桶中，控制孵化桶内温度在28℃，孵化24h，待卤虫完全孵化后，停止通气，静置3min后，打开孵化桶底阀，将沉卵和杂质放出后，将桶内剩余物质过滤，弃去溶液，收集滤渣，将滤渣用去离子水清洗3次后，得到卤虫无节幼体。经检测，本发明得到的脱壳卤虫卵在进行孵化时孵化率大幅度提高，达到了93%，比用次氯酸钠脱壳后的卤虫卵孵化率提高了15%，并且本发明去壳效果稳定，操作难度低。
实施例2
首先称取130g未成熟的山楂，经人工去籽后，用去离子水清洗4次，将洗净的山楂和550mL去离子水一同置于榨汁机中进行榨汁，得到山楂汁；称取150g卤虫卵加入到烧杯中，再加入350mL质量分数为8%氯化钠溶液和250mL上述山楂汁，曝气处理3h，使卤虫卵充分吸水膨胀，再用纱布过滤，收集卤虫卵，得到预处理卤虫卵；然后取350g新鲜猪胆汁和3g磷脂酶C加入到盛有350mL去离子水的烧杯中，搅拌混合4min后，再加入上述预处理卤虫卵，并通入空气，控制气流量为60m3/（m2·min），浸泡处理35min，使卤虫卵壳中的磷脂和胆固醇分解，再用纱布过滤，收集卤虫卵，备用；再按重量份数计，称取15份橄榄油，25份蛋白胨，10份酵母粉，0.4份磷酸氢二钾，0.2份硫酸镁和650份去离子水，加入到培养皿中，搅拌混合4min后，置于灭菌箱中，在95℃下灭菌8min，得到发酵培养基；将上述发酵培养基转移至发酵罐中，再按7%的接种量将皱褶假丝酵母菌接种到发酵罐中，在28℃下发酵2天后，再加入备用的卤虫卵和0.4g木瓜蛋白酶，并通入空气，好氧发酵3h，发酵结束，收集发酵罐内的物料，并用纱布过滤，收集滤渣，并用去离子水洗涤4次后，再用去离子水洗去脱壳卵表面的酶和菌，得到脱壳卤虫卵。
首先将玻璃钢孵化桶用质量分数为75%无水乙醇溶液进行消毒，静待13min后，向孵化桶内加入23L质量分数为5%氯化钠溶液，并通入空气，控制气流量为60m3/（m2·min），随后将氯化钠溶液质量13%的脱壳卤虫卵倒入孵化桶中，控制孵化桶内温度在30℃，孵化25h，待卤虫完全孵化后，停止通气，静置4min后，打开孵化桶底阀，将沉卵和杂质放出后，将桶内剩余物质过滤，弃去溶液，收集滤渣，将滤渣用去离子水清洗4次后，得到卤虫无节幼体。经检测，本发明得到的脱壳卤虫卵在进行孵化时孵化率大幅度提高，达到了94%，比用次氯酸钠脱壳后的卤虫卵孵化率提高了17%，并且本发明去壳效果稳定，操作难度低。
实施例3
首先称取150g未成熟的山楂，经人工去籽后，用去离子水清洗5次，将洗净的山楂和600mL去离子水一同置于榨汁机中进行榨汁，得到山楂汁；称取200g卤虫卵加入到烧杯中，再加入400mL质量分数为8%氯化钠溶液和300mL上述山楂汁，曝气处理4h，使卤虫卵充分吸水膨胀，再用纱布过滤，收集卤虫卵，得到预处理卤虫卵；然后取400g新鲜猪胆汁和4g磷脂酶C加入到盛有400mL去离子水的烧杯中，搅拌混合5min后，再加入上述预处理卤虫卵，并通入空气，控制气流量为70m3/（m2·min），浸泡处理40min，使卤虫卵壳中的磷脂和胆固醇分解，再用纱布过滤，收集卤虫卵，备用；再按重量份数计，称取20份橄榄油，30份蛋白胨，12份酵母粉，0.5份磷酸氢二钾，0.3份硫酸镁和700份去离子水，加入到培养皿中，搅拌混合5min后，置于灭菌箱中，在100℃下灭菌10min，得到发酵培养基；将上述发酵培养基转移至发酵罐中，再按8%的接种量将皱褶假丝酵母菌接种到发酵罐中，在30℃下发酵3天后，再加入备用的卤虫卵和0.5g木瓜蛋白酶，并通入空气，好氧发酵4h，发酵结束，收集发酵罐内的物料，并用纱布过滤，收集滤渣，并用去离子水洗涤5次后，再用去离子水洗去脱壳卵表面的酶和菌，得到脱壳卤虫卵。
首先将玻璃钢孵化桶用质量分数为75%无水乙醇溶液进行消毒，静待15min后，向孵化桶内加入25L质量分数为5%氯化钠溶液，并通入空气，控制气流量为70m3/（m2·min），随后将氯化钠溶液质量15%的脱壳卤虫卵倒入孵化桶中，控制孵化桶内温度在32℃，孵化26h，待卤虫完全孵化后，停止通气，静置5min后，打开孵化桶底阀，将沉卵和杂质放出后，将桶内剩余物质过滤，弃去溶液，收集滤渣，将滤渣用去离子水清洗5次后，得到卤虫无节幼体。经检测，本发明得到的脱壳卤虫卵在进行孵化时孵化率大幅度提高，达到了96%，比用次氯酸钠脱壳后的卤虫卵孵化率提高了20%，并且本发明去壳效果稳定，操作难度低。