本发明涉及罗汉果植物繁殖领域，特别是一种罗汉果高效脱毒的组织培养方法。
技术背景
罗汉果(Siraitiagrosvenorii)是我国传统出口创汇商品之一，味甘性凉，有润肺止咳、生津止渴的功效、适用于肺热或肺燥咳嗽、百日咳及暑热伤津口渴等，此外还有润肠通便的功效。是国家首批批准的药食两用材料之一，在广西民间以有300多年的药用历史，被誉为“东方神果”。
长期以来，罗汉果在种植过程中主要采用压蔓方式进行繁殖，以致品种退化、病虫危害严重等问题，尤其是病毒病，严重地块其发病率高达100％，造成巨大泾济损失。近年来，罗汉果生产中主要采用组培苗繁殖，但实践表明，市场上销售的组培苗因为大多具有潜伏病毒病，以致大田种植中病毒病暴发，严重影响产量和品质(林纬等,广西罗汉果病毒病发生情况调查.植物保护,2003.29(4):27-30；唐学军与孙桂春,罗汉果病毒病综合治理.广西农学报,2006.21(5):43-44；梁惠凌,蒋水元与李虹,罗汉果组培苗病毒病流行因子的调查.特产研究,2008.30(2):50-52)。申请号为201510290985.0的发明专利公开了一种罗汉果组培苗繁育方法，其选取的是健康的罗汉果植株作为繁殖素材，并不是专门针对含有带有病毒的罗汉果植株，其公开的处理方法中只是对繁殖素材进行简单地杀菌处理，虽取得一定效果，但尚需改善提高，并且其利用的培养基成分比较普通，无法在培养中进一步杀毒，真正杜绝病毒病的爆发。
因此，设计一种罗汉果高效脱毒的组织培养方法成为一个亟需解决的问题。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种罗汉果高效脱毒的组织培养方法，其中包括：
将外植体进行消毒得到无菌外植体；将所得无菌外植体接种至MS诱导培养基中进行诱导培养得到无菌试管苗；将所得无菌试管苗于MS预培养基中进行预培养得到预培养试管苗；将所得的预培养试管苗接种至MS脱毒培养基中进行脱毒培养得到试管丛生芽；选取健壮的试管丛生芽接种至1/2MS生根培养基中进行生根培养得到带根植株，最后将所得的带根植株进行练苗和移栽得到罗汉果幼株；
其中，所述MS诱导培养基至少包含0.5-1.0mg/L的金刚烷酮，所述MS预培养基至少包含0.5-1.0mg/L的金刚烷酮和0.1-0.6mg/L的硝酸银。
优选的是，所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法中，选取带病毒的罗汉果植株新萌发的嫩芽作为外植体，然后将所得的外植体剥去叶后，依次用体积分数为1-3％的洗洁精水溶液浸泡5min、自来水冲洗15-20min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升体积分数为0.1-0.2％的升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到所述无菌外植体。
优选的是，所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法中，在接种至MS诱导培养基之前，先将无菌外植体切成带有一个腋芽的茎段。
优选的是，所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法中，所述MS诱导培养基包含：0.3mg/L的6-BA、0.1mg/L的IAA、0.5-1.0mg/L的金刚烷酮、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，pH值为5.5-6。
优选的是，所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法中，所述诱导培养的培养条件为：温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天，培养时间为30天。
优选的是，所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法中，所述MS预培养基包含：0.5mg/L的6-BA、0.2mg/L的IBA、0.5-1.0mg/L的金刚烷酮、0.1-0.6mg/L的硝酸银、30g/L蔗糖，pH值为5.5-6，预培养的时间为9-11天。
优选的是，所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法中，所述脱毒培养步骤中，从所述预培养试管苗剥取0.2-0.3mm的茎尖分生组织，将所得的茎尖分生组织接种所述脱毒培养基中，温度为23-27℃的条件下黑暗培养20天，得到所述试管丛生芽。
优选的是，所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法中，所述脱毒培养基包含：0.2-1.0mg/L的TDZ、0.1-0.5mg/L的ZT、0.1-1.0mg/L的IBA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，pH值为5.5-6。
优选的是，所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法中，所述生根培养基包含：0.2-1.0mg/L的NAA、1.5g/L的AC、10/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
所述生根培养的条件为：温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天，培养时间为20天。
优选的是，所述的罗汉果高效脱毒的组织培养方法中，所述练苗和移栽具体包括：将所得的带根植株使用自来水培养一周，待表面角质形成后，将幼苗取出，洗净根部，再使用完全培养液培养一个月后移栽到大田即得到罗汉果幼株。完全培养液为常规使用的植物培养液，在市场上可以购得，或是自行配制，只要能将幼苗培养成幼株即可。
本发明具有以下有益效果：首先本发明用生物技术对罗汉果进行组织培养脱毒繁殖，通过罗汉果芽原基脱毒的培养，在短时间内可培育出大量适合栽培种植的罗汉果幼苗，保障罗汉果种苗的增殖系数和种苗质量，实现规模化生产，满足生产上的需要。
其次，采用本发明所述的培养方法得到的罗汉果丛生芽增殖系数达到20-30倍，丛生芽健壮，接种到生根培养基后容易生根，生根率可达95％以上，成活率95％。。
再次，本发明针对的是带有病毒的罗汉果植株，对其进行杀菌后，利用特别地培养基进行诱导培养和预培养，得到真正无毒的试管苗，然后在利用这样无毒的试管苗进行培养得到丛生芽，再培养得到带根植株，最后进行练苗和移栽得到真正无毒的罗汉果幼株。
最后，本发明的MS诱导培养基包含0.5-1.0mg/L的金刚烷酮，MS预培养基至少包含0.5-1.0mg/L的金刚烷酮和0.1-0.6mg/L的硝酸银，能够在培养过程中有效清除组织携带的病毒，得到真正无毒无菌的试管苗。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细说明，以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施。
一种罗汉果高效脱毒的组织培养方法，包括以下步骤：
(1)外植体的选择与消毒：取罗汉果带病毒的植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去叶后，依次用2％(v/v)洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-20min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1％(v/v)升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到无菌外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水。
(2)外植体初代诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的无菌外植体将步骤(1)得到的外植体置于超净工作台内，用解剖刀切成带有一个腋芽的茎段，接种到MS培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养30天得到无菌试管苗，其中MS诱导培养基中添加0.3mg/L的6-BA、0.1mg/L的IAA、0.5-1.0mg/L的金刚烷酮、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
(3)试管苗脱毒预培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于液体MS预培养基中，震荡培养10天得到预培养试管苗，其中MS预培养基中添加0.5mg/L的6-BA、0.2mg/L的IBA、0.5-1.0mg/L的金刚烷酮、0.1-0.6mg/L的硝酸银、30g/L蔗糖，培养基的pH值为5.8。
(4)试管苗脱毒培养：将步骤(3)中得到的预培养试管苗剥去0.2-0.3mm的茎尖分生组织，将所得的茎尖分生组织接种到MS脱毒培养基中，在培养温度23-27℃的条件下黑暗培养20天得到试管苗丛生芽，其中MS脱毒培养基中含0.2-1.0mg/L的TDZ、0.1-0.5mg/L的ZT、0.1-1.0mg/L的IBA、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。TDZ为植物生长调节剂，市场有售，ZT为玉米素，是细胞分离素，市场有售。
(5)重复步骤(4)3～5次得到大量健壮的罗汉果试管丛生芽。
(6)将步骤(5)中得到的健壮的试管从芽剪切成单芽接种到1/2MS生根培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养20天，得到完整带根植株，其中MS生根培养基中含0.2-1.0mg/L的NAA、1.5g/L的AC、10/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。AC为活性炭。
(7)炼苗与移栽：组培瓶中加入50ml自来水，松开瓶盖，炼苗一周，待表面角质形成后，将幼苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到营养杯中，在营养杯中生长一个月后移栽到大田。
实施例1：
(1)植体的选择与消毒：取罗汉果带病毒的植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去叶后外，依次用2％(v/v)洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15min、添加了2滴吐温-20的100毫升0.1％(v/v)升汞消毒8min、无菌水冲洗3次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到无菌外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水。
(2)外植体初代诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的无菌外植体置于超净工作台内，用解剖刀切成带有一个腋芽的茎段，接种到MS培养基中，在培养温度为23℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下培养30天得到无菌试管苗，其中MS诱导培养基中添加0.3mg/L的6-BA、0.1mg/L的IAA、0.5mg/L的金刚烷酮、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
(3)试管苗脱毒预培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于液体MS预培养基中，震荡培养10天得到预培养试管苗，其中MS预培养基中添加0.5mg/L的6-BA、0.2mg/L的IBA、0.5mg/L的金刚烷酮、0.2mg/L的硝酸银、30g/L蔗糖，培养基的pH值为5.8。
(4)试管苗脱毒培养：将步骤(3)中得到的预培养试管苗剥去0.2mm的茎尖分生组织，将茎尖分生组织接种到MS脱毒培养基中，在培养温度23-27℃的条件下黑暗培养30天得到试管苗丛生芽，其中MS脱毒培养基中含0.5mg/L的TDZ、0.3mg/L的ZT、0.5mg/L的IBA、0.1-0.5mg/L的硝酸银、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
(5)重复步骤(4)3次得到大量健壮的罗汉果试管丛生芽。
(6)将步骤(5)中得到的健壮试管丛生芽剪切成单芽接种到1/2MS生根培养基中，在培养温度为23℃，光照强度1500lux，光照时间为8小时/天的条件下培养20天，得到完整带根植株，其中1/2MS培养基中添加了0.5mg/L的NAA、1.5g/L的AC、10/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
(7)炼苗与移栽：组培瓶中加入50ml自来水，松开瓶盖，将带根植株炼苗一周，待表面角质形成后，将幼苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到营养杯中，在营养杯中生长一个月后移栽到大田。
经观察和记录发现，生根率达96％，成活率达95％。
实施例2
(1)植体的选择与消毒：取罗汉果带病毒的植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去叶后外，依次用2％(v/v)洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗20min、添加了3滴吐温-20的100毫升0.1％(v/v)升汞消毒9min、无菌水冲洗4次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到无菌外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水。
(2)外植体初代诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的无菌外植体置于超净工作台内，用解剖刀切成带有一个腋芽的茎段，接种到MS诱导培养基中，在培养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养30天得到无菌试管苗，其中MS诱导培养基中添加0.3mg/L的6-BA、0.1mg/L的IAA、0.7mg/L的金刚烷酮、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
(3)试管苗脱毒预培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于液体MS预培养基中，震荡培养10天得到预培养试管苗，其中MS预培养基中添加0.5mg/L的6-BA、0.2mg/L的IBA、0.8mg/L的金刚烷酮、0.3mg/L的硝酸银、30g/L蔗糖，培养基的pH值为5.8。
(4)试管苗脱毒培养：将步骤(3)中得到的预培养试管苗剥去0.3mm的茎尖分生组织，将茎尖分生组织接种到MS脱毒培养基中，在培养温度25℃的条件下黑暗培养30天得到试管苗丛生芽，其中MS脱毒培养基中含0.7mg/L的TDZ、0.3mg/L的ZT、0.5mg/L的IBA、0.1-0.5mg/L的硝酸银、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
(5)重复步骤(4)4次得到大量健壮的罗汉果试管丛生芽。
(6)将步骤(5)中得到的健壮试管丛生芽剪切成单芽接种到1/2MS生根培养基中，在培养温度为25℃，光照强度1500lux，光照时间为9小时/天的条件下培养20天，得到完整带根植株，其中1/2MS生根培养基中添加了0.5mg/L的NAA、1.5g/L的AC、10/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
(7)炼苗与移栽：组培瓶中加入50ml自来水，松开瓶盖，炼苗一周，待表面角质形成后，将幼苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到营养杯中，在营养杯中生长一个月后移栽到大田。
经记录统计，发现生根率达97％，成活率达97％。
实施例3
(1)植体的选择与消毒：取罗汉果带病毒的植株新萌发的嫩芽作为外植体，剥去叶后外，依次用2％(v/v)洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗30min、添加了3滴吐温-20的100毫升0.1％(v/v)升汞消毒10min、无菌水冲洗5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到无菌外植体，其中无菌水为经高压灭菌的蒸馏水。
(2)外植体初代诱导获得无菌试管苗：将步骤(1)得到的无菌外植体置于超净工作台内，用解剖刀切成带有一个腋芽的茎段，接种到MS诱导培养基中，在培养温度为27℃，光照强度1500lux，光照时间为0小时/天的条件下培养30天得到无菌试管苗，其中MS繁殖培养基中添加0.3mg/L的6-BA、0.1mg/L的IAA、1.0mg/L的金刚烷酮、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
(3)试管苗脱毒预培养：将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于液体MS预培养基中，震荡培养10天得到无菌试管苗，其中MS预培养基中添加0.5mg/L的6-BA、0.2mg/L的IBA、1.0mg/L的金刚烷酮、0.6mg/L的硝酸银、30g/L蔗糖，培养基的pH值为5.8。
(4)试管苗脱毒培养：将步骤(3)中得到的无菌试管苗剥去0.3mm的茎尖分生组织，将茎尖分生组织接种到MS脱毒培养基中，在培养温度27℃的条件下黑暗培养30天得到试管苗丛生芽，其中MS脱毒培养基中含1.0mg/L的TDZ、0.5mg/L的ZT、0.5mg/L的IBA、0.1-0.5mg/L的硝酸银、30g/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
(5)重复步骤(4)5次得到大量健壮的罗汉果试管丛生芽。
(6)将步骤(5)中得到的健壮丛生芽剪切成单芽接种到1/2MS生根培养基中，在培养温度为27℃，光照强度1500lux，光照时间为10小时/天的条件下培养20天，得到完整带根植株，其中1/2MS培养基中添加了0.5mg/L的NAA、1.5g/L的AC、10/L蔗糖和5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
(7)炼苗与移栽：组培瓶中加入50ml自来水，松开瓶盖，炼苗一周，待表面角质形成后，将幼苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到营养杯中，在营养杯中生长一个月后移栽到大田。
经记录统计，生根率达到97％，成活率为99％。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。