本发明涉及植物组织培养，尤其是涉及一种苤蓝组织培养快速繁殖方法。
背景技术：
苤蓝(Brassica oleracea L.var.caulorapa DC.)，又名球茎甘蓝、擘蓝和芥蓝头等，是十字花科芸薹属二年生草本植物。原产于欧洲地中海至北海沿岸，由叶用甘蓝变异而来，食用部分为膨大的肉质球茎。苤蓝有很高的营养价值和药用功效，不仅富含钙、磷、铁等微量元素，而且所含的硫代萝卜素，能促进动物和人体细胞产生抗癌的酶。近期研究表明，苤蓝皮作为吸附剂用于处理染料废水，吸附过后可作无害化焚烧处理，避免产生二次污染，发展前景广阔。
自然条件下，苤蓝以种子繁殖，植株通过抽薹开花结子，不但生产周期较长，结实部位因繁殖生长而失去商品性，使其经济效益下降。由于对高温敏感，华南地区种植的苤蓝在温度较高的4～10月，常无法抽薹、不产生花粉，影响结实的产量；而且，苤蓝未熟抽薹问题严重，不仅使商品球茎质量下降，而且造成种子不育、败育，给种子生产造成重大损失。因此，在华南地区，苤蓝的制种难度大、存在严重制约因素。
植物组织培养也叫植物离体培养或无菌培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，在无菌条件下，将离体的植物器官诱导产生愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整植株的一种技术。由于植物组织培养不受外在环境因子的影响可终年进行，并且可重复进行，所以能节省大量的时间和空间。组织培养再生植株为加速种苗的繁殖与推广提供了有效手段。利用苤蓝的有效组织快繁技术，可以克服苤蓝的制种难题。
在华南地区种植苤蓝，由于对高温、高湿敏感，在春、夏、秋季，苤蓝肉质球茎常发生软腐病，大规模种植苤蓝也存在困难。因此，选择高抗“软腐病”、生长期短、品质优良的品种，则是在华南地区的优先种植品种。筛选出的优良品种，则需通过无性繁殖方式才能保存其优良品质。
倪春锋等(倪春锋、蒋明、胡齐赞，紫苤蓝组织培养快繁技术，浙江农业科学，2010(3))应用紫苤蓝种子无菌萌发苗的叶柄、胚轴、子叶、叶柄和叶片为外植体材料，成功进行愈伤组织诱导培养，并且报道叶柄的出愈率最高，达96％。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种苤蓝组织培养快速繁殖方法。
本发明包括以下步骤：
1)采用苤蓝球茎顶端簇生叶的基部芽丛和球茎侧叶基部腋芽作为外植体，留取部分膨大块茎，去除叶片后清洗；
在步骤1)中，所述清洗可先用水冲洗，再用50％洗洁精进行超声清洗，最后用水将洗洁精洗净。
2)试材移至超净工作台，将清洗后的苤蓝组织小块消毒；
在步骤2)中，所述消毒的具体方法可为：将清洗后的苤蓝组织小块浸于75％乙醇消毒30s，无菌水冲洗3遍，沥干水分，再浸于加2滴吐温80的0.1％升汞中消毒5～10min，取出无菌水冲洗3～5遍，再沥干水分。
3)将经过消毒的带顶芽或腋芽的苤蓝茎块切成组织小块作为外植体，接种于培养基中进行愈伤诱导；
在步骤3)中，所述切成组织小块可切成1.0～1.5cm组织小块；所述培养基的组成可为改良MS培养基+细胞分裂素6-苄基腺嘌呤(6-BA)(1.0～2.0)mg/L+生长素a-萘乙酸(NAA)(0.1～0.5)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+琼脂(6.5～8)g/L，培养基的pH值为(5.8～6.2)愈伤诱导；所述愈伤诱导的条件可为：培养周期(10～20)d，培养温度(20～26)℃，光照强度1500lux左右，光照时间12h/d。
4)愈伤形成后，移入增殖培养基中培养，使诱导芽形成，丛芽增殖；
在步骤4)中，所述增殖培养基的组成可为：改良MS培养基+细胞分裂素6-苄基腺嘌呤(6-BA)(1.0～2.0)mg/L+生长素a-萘乙酸(NAA)(0.1～0.5)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+琼脂(6.5～8)g/L，培养基的pH值为5.8～6.2；所述培养的条件可为培养周期(20～30)d，培养温度(20～26)℃，光照强度2500lux，光照时间12h/d。
5)将步骤4)得到的诱导芽和丛芽进行生根培养；
在步骤5)中，所述生根培养的生根培养基的组成可为：改良MS培养基+细胞分裂素6-苄基腺嘌呤(6-BA)(0.05～0.1)mg/L+生长素a-萘乙酸(NAA)(0.1～0.5)mg/L+蔗糖(15～25)g/L+琼脂(6.5～8)g/L，培养基的pH值为5.8～6.2；所述生根培养的条件可为：培养周期(10～20)d，培养温度(20～26)℃，光照强度2500lux，光照时间12h/d。
6)当幼苗的根系长出3～4根、长度为2～3cm，幼苗形体已显健壮时，将幼苗取出，在清水中洗净附着在根上的培养基，将洗净的幼苗排好，用清水喷湿，然后分别以珍珠岩和腐殖土为基质进行炼苗后，将幼苗移栽定植即可。
在步骤6)中，所述炼苗的条件可在温度20～25℃，湿度60％～80％的条件下炼苗7～15d。
本发明提供一种更适于苤蓝增殖生长的改良MS培养基，改变了其中的大量元素的组成和含量，减少了基本培养基中盐分的总摩尔数，提高了外植体的增殖率，消除了植株玻璃化现象。以植株基部芽丛或球茎侧叶基部腋芽作为外植体材料，适用于新品种选育、优良单株或无性系保育、雄性不育株的保存与利用等方面，可大量、快速获得无性组培苗，应用于商业化生产。
与倪春锋等人在《浙江农业科学》2010年第3期发表的《紫苤蓝组织培养快繁技术》相比，本发明具有以下优点：
1)本发明的材料是以成株的顶芽或腋芽为外植体，倪春锋等人以种子无菌萌发苗为材料。
2)本发明不需要倪春锋等人提出的种子培养过程。
3)本发明的愈伤和增殖培养基是改良MS基本培养基(4/5大量元素)+6-BA1.0～2.0mg/L+NAA0.1～0.5mg/L+蔗糖25～30g/L+琼脂6.5～8g/L，倪春锋等人报道的愈伤培养基是MS+6-BA 4mg/L+NAA 0.02mg/L；本发明的生根培养基是改良MS基本培养基+6-BA 0.05-0.1mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+蔗糖15-25g/L+琼脂6.5-8g/L；倪春锋等人报道的生根培养基是MS+6-BA 4mg/L+NAA 0.1-0.5mg/L；倪春锋等人的增殖和生根培养基区别，是NAA浓度的变化；本发明的增殖和生根培养基区别，是6-BA和蔗糖的浓度变化。
4)本发明解决苤蓝成年植株的组织培养问题，而倪春锋等人研究是解决紫苤蓝(苤蓝的一个品种)种子无菌苗组织培养问题。
本发明以苤蓝芽点为外植体，诱导愈伤组织，进而分化诱导丛生芽的形成，在大量繁殖后，进行炼苗移栽。采用本发明植物组织培养法外植体繁殖系数高，短时间(30天)内便可获得大量优质种苗，同时减少了基本培养基中盐分的总摩尔数，不但可以解决长期瓶苗转接的瓶苗质量退化问题，而且能够有效防止瓶苗玻璃化现象的发生，尽早播种还降低了田间栽培的早抽薹现象。
本发明的有益效果是：
1)高效性：本发明可快速获得苤蓝的大量组培苗，能满足大量生产的需要。
2)周期短：利用本发明组织培养的苤蓝组培苗，成苗和采收周期短，炼苗后种植40－50天便可采收球茎。
3)技术先进性：本发明中提供一种更适于苤蓝增殖生长的改良MS培养基，改变了其中的大量元素的组成和含量，减少了基本培养基中盐分的总摩尔数，提高了外植体的增殖率，消除了植株玻璃化现象。
4)取材容易：本发明采用苤蓝的芽点作为外植体，对于所有的苤蓝植株均适用，普遍性强，取材容易。
5)适用性广：本发明适用于变异植株的保存、新品种的选育、优良单株或无性系的保育、雄性不育株的保存和利用，适用性广。
具体实施方式
以下实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一、采用苤蓝球茎顶端簇生芽丛作为外植体，留取部分块茎，去除叶片，清水(自来水)下冲洗10min，在超声波清洗机中加洗洁精进行清洗10min，用清水将洗洁精洗净。
二、试材移至超净工作台，将清洗完成的苤蓝组织小块浸于75％乙醇消毒30s，无菌水冲洗3遍，沥干水分，再浸于加2滴吐温80的0.1％升汞中消毒8min，取出无菌水冲洗5遍，沥干水分备用；
三、将经过消毒的带顶芽的苤蓝茎块切成0.5～1.0cm组织小块作为外植体，接种于改良MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖25g/L+琼脂7g/L，培养基的pH值为6.0进行愈伤诱导。培养周期15d，培养温度25℃左右，光照强度1500lux左右，光照时间12h/d。
四、愈伤组织形成后，移入增殖培养基，增殖培养基为改良MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.3mg/L+蔗糖25g/L+琼脂7g/L，培养基的pH值为6.0，诱导芽形成及丛芽的增殖；培养周期15天，培养温度20～26℃，光照强度2500lux，光照时间12h/d。
五、生根培养基选用改良MS培养基+细胞分裂素6-苄基腺嘌呤(6-BA)(0.05～0.1)mg/L+生长素a-萘乙酸(NAA)0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，培养基的pH值为6.0，培养周期15d，培养温度20～26℃，光照强度1500lux，光照时间12h/d。
六、当幼苗的根系长出3～4根、长度为2～3cm，幼苗形体已显健壮时，将幼苗取出，在清水中洗净附着在根上的培养基，然后以珍珠岩︰腐殖土＝1︰1为基质，在温度25℃左右，湿度60％～80％的条件下炼苗15～30d，将幼苗移栽定植即可。
实施例2
一、以苤蓝球茎上的腋芽作为外植体，留取部分块茎及叶柄，去除叶片，清水(自来水)下冲洗5min，在超声波清洗机中加50％洗洁精进行清洗10min，用清水将洗洁精洗净。
二、试材移至超净工作台，将清洗完成的苤蓝组织小块浸于75％乙醇消毒30s，无菌水冲洗3遍，沥干水分，再浸于加2滴吐温80的0.1％升汞中消毒5min，取出无菌水冲洗5遍，沥干水分备用。
三、将经过消毒苤蓝腋芽茎块切成1.0～1.5cm组织小块作为外植体，接种于进行愈伤诱导及丛生芽培养。培养周期15d，培养温度25℃左右，光照强度2500lux左右，光照时间12h/d。
四、将苤蓝丛生芽单株分离，回接原诱导培养基，即改良MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖25g/L+琼脂7g/L，培养基的pH值为5.8～6.2，进行重复增殖培养，培养周期15天，培养温度20～26℃，光照强度2500lux，光照时间12h/d。
五、选用单株茎直立粗壮，且幼苗的根系长出3～4根、长度为2～3cm的植株，将幼苗取出，在清水中洗净附着在根上的培养基，然后以珍珠岩︰腐殖土＝1︰1为基质，在温度25℃左右，湿度60％～80％的条件下炼苗7～15d，将幼苗移栽定植即可。