具有新Rht-B1等位基因的小麦的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及包含改变的Rht-Blc等位基因的小麦的过度生长突变体。本发明还涉 及来自此类植物的谷粒和由所述谷粒衍生的产品。
【背景技术】
[0002] 植物部分地或全部地通过调节生长速率来对发育、生理和环境信号做出响应。已 对很多机制进行了描述，包括改变植物激素赤霉素（GA)类的含量（由Yamaguchi综述， 2008)或与GA相关的信号传导组分，例如蛋白质GIDl和DELLA (由Sun综述，2010)。这些 导致GA信号传导的动态调节，使得生长与来自其他激素调节途径的信号传导和环境因素 (例如光、温度和水利用率）相协调（Hartweck，2008 ;Achard和Genschik，2009 ;Kuppusamy 等，2009)。已提议通过昼夜节律钟门控GA信号传导来解释生长速率的昼夜差异（Arana等， 2011)〇
[0003] 已对植物中的多种赤霉素（GA)突变体（自然发生或在诱变后被鉴定）进行了表 征。这些突变体包括通常由GA含量或GA信号传导的改变导致的不同的矮化和伸长（"细 长"）表型。鉴定相关的基因并对其编码的蛋白质进行分析有助于形成对通过GA调节生长 的理解，特别是在模型物种水稻和拟南芥（Arabidopsis)中。生物活性GA与GA受体蛋白结 合（"GID1"，Ueguchi-Tanaka 等，2005 ;Murase 等，2008 ;Shimada 等，2008)并形成随后被 DELLA蛋白结合的复合物，DELLA蛋白被鉴定为发挥生长抑制因子作用的GRAS转录因子家 族的一个亚族（Griffiths 等，2006 ;Willige 等，2007 ;Hirano 等，2010)。在一种情况下，证 据表明DELLA与PIF转录因子结合阻止它们对增强生长所需基因之表达的促进（de Lucas 等，2008 ;Feng 等，2008)。
[0004] 大麦和水稻的Delia突变体受到特别关注，因为它们包括两种显著不同的表型： 高度伸长的"细长"型和"GA不敏感的"矮化型。前者性状是隐形的并且特征为极度GA响应， 而后者则是显性的或半显性的。编码DELLA之Slenderl基因中的不同单核苷酸替换导致这 些根本不同的表型（"伸长细长"或"矮化细长"，Ikeda等，2001 ;Chandler等，2002 ;Asano 等，2009)。前者涉及消除DELLA抑制生长之能力的突变，而后者是由于无法与GA-GIDl复 合物结合导致的DELLA累积。
[0005] 普通小麦是六倍体，DELLA由分别位于小麦A、B和D基因组的染色体4AL、4BS和 4DS上的三个同源基因（Rht-AURht-BURht-Dl)编码，其中"L"表示染色体的长臂而"S"表 示染色体的短臂。这使对小麦突变体的研宄变得更加困难，并且因此，与水稻和大麦相比， 对小麦了解得更少。已对B和D基因组的"GA不敏感"半矮化等位基因进行了描述（Peng 等，1999 ;Pearce等，2011)。极度矮化等位基因的一个实例为通过插入DNA元件而产生B 基因组中的Rht-Blc等位基因。预计该插入物的大部分将从基因的转录物中被剪接掉，但 保留了 90个核苷酸并预计在DELLA中产生30个氨基酸的框内插入物（Pearce等，2011 ;Wu 等，2011)。
[0006] 由于半矮化基因对作物产量的有益作用，自绿色革命（Green Revolution)以来， 其在小麦和水稻育种方面一直是重要的。半矮化植物高度的适度（10%至20%)降低归因 于内源性GA的生长促进的缺陷。在水稻中，这由GA生物合成基因突变造成，使得存在较少 活性的 GA (Monna 等，2002 ;Sasaki 等，2002 ;Spielmeyer 等，2002)。相比之下，在小麦中， Delia基因的矮化突变导致对GA相对"不敏感"的生长（Peng等，1999)。原始半矮化突变 体是自发产生的，并且其农学重要性由其自首次引进后约50年在当前品种中的持续广泛 使用而显而易见。然而，现存的Rht等位基因具有一些缺点。
[0007] 因此，仍然需要改良的半矮化小麦品种。
【发明内容】
[0008] 在第一方面，本发明提供了一种小麦植物，其包含编码Rht-Bl多肽的Rht-Bl等位 基因，所述多肽包含N端结构域和C端结构域，其中该C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸具有至少98%的同一性，并且其中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列 与SEQ ID NO :5所示序列的不同之处在于至少⑴在SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之 间插入了一个或更多个氨基酸，和（ii)该C端结构域中相对于SEQ ID NO :5的50-621位 氨基酸的一个或更多个氨基酸替换。
[0009] 在第二方面，本发明提供了一种小麦植物，其包含编码Rht-Bl多肽的Rht-Bl等位 基因，所述多肽包含N端结构域和C端结构域，其中该C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸具有至少98%的同一性，其中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO :5所示序列的不同之处在于至少在SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间插入 了一个或更多个氨基酸，并且其中所述Rht-Bl等位基因的核苷酸序列与SEQ ID NO :1所示 核苷酸序列的不同之处至少在于存在内含子剪接位点突变。
[0010] 在第三方面，本发明提供了小麦谷粒，其包含编码Rht-Bl多肽的Rht-Bl等位基 因，所述多肽包含N端结构域和C端结构域，其中该C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO : 5的50-621位氨基酸具有至少98%的同一性，并且其中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO :5所示序列的不同之处在于至少（i)在SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间 插入了一个或更多个氨基酸，和（ii)该C端结构域中相对于SEQ ID NO :5的50-621位氨 基酸的一个或更多个氨基酸替换。
[0011] 在第四方面，本发明提供了小麦谷粒，其包含编码Rht-Bl多肽的Rht-Bl等位基 因，所述多肽包含N端结构域和C端结构域，其中该C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO : 5的50-621位氨基酸具有至少98%的同一性，其中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的不同之处在于至少在SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间插入了一 个或更多个氨基酸，并且其中所述Rht-Bl等位基因的核苷酸序列与SEQ ID NO :1所示核苷 酸序列的不同之处至少在于存在内含子剪接位点突变。
[0012] 在第五方面，本发明提供了小麦细胞，其包含编码Rht-Bl多肽的Rht-Bl等位基 因，所述多肽包含N端结构域和C端结构域，其中该C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO : 5的50-621位氨基酸具有至少98%的同一性，并且其中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列与 SEQ ID NO :5所示序列的不同之处在于至少（i)在SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间 插入了一个或更多个氨基酸，和（ii)该C端结构域中相对于SEQ ID NO :5的50-621位氨 基酸的一个或更多个氨基酸替换。在一个优选实施方案中，小麦细胞是小麦胚乳细胞。这 样的小麦胚乳细胞不能够再生成小麦植株。
[0013] 在第六方面，本发明提供了小麦细胞，其包含编码Rht-Bl多肽的Rht-Bl等位基 因，所述多肽包含N端结构域和C端结构域，其中该C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO : 5的50-621位氨基酸具有至少98%的同一性，其中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的不同之处在于至少在SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间插入了一 个或更多个氨基酸，并且其中所述Rht-Bl等位基因的核苷酸序列与SEQ ID NO :1所示核苷 酸序列的不同之处至少在于存在内含子剪接位点突变。在一个优选实施方案中，小麦细胞 是小麦胚乳细胞。这样的小麦胚乳细胞不能够再生成小麦植株。
[0014] 在第七方面，本发明提供了编码Rht-Bl多肽的核酸分子，所述多肽包含N端结构 域和C端结构域，其中该C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸具有 至少98%的同一性，并且其中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的 不同之处在于至少（i)在SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间插入了一个或更多个氨基 酸，和（ii)该C端结构域中相对于SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸的一个或更多个氨基 酸替换。这样的核酸分子不是天然存在的。这样的核酸分子可以是分离的或者作为转基因 植物中的转基因。
[0015] 在第八方面，本发明提供了编码Rht-Bl多肽的核酸分子，所述多肽包含N端结构 域和C端结构域，其中该C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸具有 至少98%的同一性，其中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的不同 之处在于至少在SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间插入了一个或更多个氨基酸，并且 其中所述Rht-Bl等位基因的核苷酸序列与SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的不同之处至少 在于存在内含子剪接位点突变。这些核酸分子不是天然存在的。这些核酸分子可以是分离 的或者作为转基因植物中的转基因。
[0016] 在第九方面，本发明提供了 Rht-Bl多肽，其包含N端结构域和C端结构域，其中该 C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸具有至少98%的同一性，并且 其中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的不同之处在于至少（i)在 SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间插入了一个或更多个氨基酸，和（ii)该C端结构域 中相对于SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸的一个或更多个氨基酸替换。
[0017] 在第十方面，本发明提供了分离的寡核苷酸，其包含本发明第七或第八方面的多 核苷酸中的至少19个连续核苷酸或者与其完全互补，其中这19个连续核苷酸包括参照SEQ ID NO :1 的选自以下的至少一个核苷酸替换：G2715A、G2726A、G2747A、G2829A、G2831A、 G2849A、C2865T、C2966T、C2972T、G3065A、C3117T、G3477A、C3507T、C3519T、G3624A、G2792A、 CC2108TA、G3047A、G2864A、G3671A、G148A、G148T、G147A、G2084A 和 G2083A。
【附图说明】
[0018] 图1 :通过在平板中筛选分离的小麦过度生长突变体的实例。箭头所示为以生长 速率增加为特征的一株突变体幼苗。
[0019] 图2:与亲本植物（矮化）和野生型植物（高）相比，在控制条件下生长的小麦的 过度生长突变体。从左到右，携带Rht-Blc (矮化）、Rht-Bla (高）之Maringa的衍生品种 或Rht-Blc的三种不同过度生长衍生品种。这三种过度生长衍生品种的不同之处在于其最 终高度，并且箭头指向每种品系的穗（head)。两种衍生品种为半矮化的，第三种与野生型一 样高。
[0020] 图3 :大麦（向上箭头）和小麦（向下箭头）过度生长突变体的DELLA多肽C端 GRAS结构域中的氨基酸替换位点的示意图。标出了保守的氨基酸区域。
[0021] 图4 :年龄相同的大麦幼苗（从左到右）：Himalaya(WT)、M463 (grd2b)、 TR261(grd2b、slnlm)、M240(slnlm)、M640(Slnld)、TR107(Slnld. 10)、TR60(Slnld. 8)。
[0022] 图5 :-些小麦突变体品系中改变的形态。正常（左）和异常（右）形态的一个 实例，其中后者以窄叶、细茎、根系发育不良和在一些情况下的比正常谷粒少的穗为特征。
[0023] 图6:来自以下品系的0嫩的双重？0?(0即]^?0〇分析（1至1〇:]\&11'；[叩011'111：-1、 Maring0 Rht-Blc对照、具有异常形态学的两种过度生长品系、具有正常形态学的两种过度 生长品系、无模板对照。大小标记物在左边。上面条带表示扩增的Rht-Blc等位基因的片 段，而下面条带为Rht-Dl基因的产物。
[0024] 图 7 :小麦中 Rht-Ala(JF930277)、Rht-Bl (JF930278)和 Rht-Dla(JF930281)编码 的氨基酸序列的ClustalW比对。
[0025] 图8 :通过Blastp对小麦Rht-Bla多肽（SEQ ID NO :5,上面序列）和拟南芥 (Arabidopsis thaliana)GAI蛋白（登录号CAA75492,下面序列）的比对。星号表示两个 多肽之间的相同（保守的）氨基酸，而" + "符号表示类似但不相同的氨基酸。
[0026] 有关序列表的说明：
[0027] SEQ ID NO :1 示出 了来自 Maringa/Rht-Blc 之 Rht-Blc 基因的 3892nt 核苷酸序 列，以蛋白质编码区的ATG开始直至该编码区末端的TGA。在将逆转录转座子的2026nt插 入物（insertion)插入到Rht-Bl基因中以使得Rht-Blc紧接前147nt之后产生。
[0028] SEQ ID NO :2示出了对应于小麦Maringa/Rht-Blc中Rht-Blc等位基因的cDNA的 1956拉核苷酸序列。该序列与661* &1^登录号1呢57971 (111等，2011)中提供的核苷酸序 列几乎相同，仅813和1851位的两个核苷酸不同。相对于来自Rht-Bla等位基因的cDNA， 所述cDNA中的90nt插入物对应于SEQ ID NO : 2的核苷酸148-237。
[0029] SEQ ID NO :3示出了由Rht-Blc等位基因编码，即由具有SEQ ID NO: 1之核苷酸 序列的基因和SEQ ID NO :2的cDNA编码的651氨基酸多肽的氨基酸序列。插入该多肽中 的30个氨基酸相对于Rht-Bla多肽为SEQ ID NO :3的50-79位氨基酸。
[0030] SEQ ID NO :4示出了对应于Rht-Bla(野生型）等位基因的cDNA的核苷酸序列， 其以ATG翻译起始密码子开始（Pearce等，2011 ;Genbank登录号JF930278)。
[0031] SEQ ID NO :5示出了 Rht-Bla多肽（野生型）的氨基酸序列（Genbank登录号 JF930278)，621 个氨基酸。
[0032] SEQ ID NO :6 不出了来自栽培品种 Xiaoyan54 的普通小麦（Triticum aestivum) Rhtl-Blb基因的7057nt核苷酸序列（Genbank登录号FN649763)。核苷酸1-2136对应于 Rht-Blb的启动子和5' UTR ;核苷酸2137-4002对应于蛋白质编码区，与野生型相比，其被 2326位C到T的核苷酸改变间断；并且核苷酸4003-7057对应于Rht-Blb的3'UTR和该基 因的3'区。
[0033] SEQ ID NO :7示出了由Rht-Blb编码的多肽的555氨基酸序列，与野生型Rht-Bla 相比，其为N端截短的Rht-Bl蛋白，截短了前66个氨基酸。翻译重新以氨基酸67起始。
[0034] SEQIDN0:8示出了普通小麦Rht-Ala基因（野生型Rht-Al)的 3463nt核苷酸 序列（Genbank登录号JF930277)。核苷酸1-1600对应于Rht-Ala的启动子和5'UTR，并且 核苷酸1601-3463对应于Rht-Ala的蛋白质编码区。该蛋白质编码区与Rht-Bla编码区具 有96%同一性。
[0035] SEQ ID NO :9示出了 Rht-Ala(野生型）多肽的620氨基酸序列。
[0036] SEQ ID NO : 10示出了对应于Rht-Dla基因的cDNA的1872核苷酸序列（Genbank 登录号 AJ242531)。
[0037] SEQ ID NO :11示出了 Rht-Dl多肽的623氨基酸序列（登录号JF930281)。
[0038] SEQ ID NO :12示出了大麦Slnl基因的618氨基酸序列（登录号AK372064)。
[0039] SEQ ID NO :13示出了拟南芥GAI多肽的532氨基酸序列（登录号CAA75492)。
[0040] SEQ ID NO : 14示出了插入到Rht-Blc多肽中30个氨基酸的氨基酸序列。
[0041] SEQ ID NO : 15示出了小麦野生型Rht-Bla多肽中"Della"基序的11氨基酸序列， 其在Rht-Blc多肽中被间断。
[0042] SEQ ID NO :16示出了 Rht-Blc基因的核苷酸序列（登录号JN857970 ;Wu等， 2011)。cDNA对应于被连接至2289-4097的核苷酸206-352。
[0043] SEQ ID NO : 17至30示出了寡核苷酸引物的核苷酸序列。
[0044] 发明详述
[0045] 植物
[0046] 本发明提供了小麦植物、其部分（例如小麦谷粒）、获自这些植株和谷粒的产品 (例如食物成分和食物产品），以及产生和使用其的方法。本文所用的术语"小麦"指物种 普通小麦（Triticum aestivum L.)或圆维小麦硬粒小麦亚种（Triticum turgidum ssp. durum)或黑小麦（Triticale)的植物、植物部分、谷粒或由其衍生的产品。普通小麦（也 称为面包小麦）是一种六倍体小麦，其具有由42条染色体构成的AABBDD基因组组构。通 常将普通小麦的和"D"亚基因组称为"基因组"。圆锥小麦硬粒小麦亚种（通常 称为硬粒小麦）是一种四倍体小麦，其具有由28条染色体构成的AABB基因组组构。六倍 体或四倍体小麦的二倍体亲本包括A基因组的小麦属（Triticum sp.)，例如乌拉尔图小 麦（T. uartu)、栽培一粒小麦（T. monococcum)或野生一粒小麦（T. boeoticum) ;B基因组 的拟斯卑尔脱山羊草（Aegilops speltoides)和D基因组的粗小麦（T.tauschii ;也称为 节节麦（Aegilops squarrosa)或粗山羊草（Aegilops tauschii))，但是其不涵盖在本文 使用的"小麦"中。然而，通过常规技术使用普通小麦作为亲本与非小麦物种黑麦（Secale cereale)进行有性杂交产生的植物涵盖在本文使用的"小麦"中，所述杂交后代在本文中被 称为黑小麦。优选地，小麦植物适于商业化生产谷粒，例如具有本领域技术人员已知的合适 农学特征的面包小麦或硬粒小麦的市售品种。
[0047] 在第一方面，本发明提供了小麦植物，其包含编码变体（非野生型）Rht-Bl多肽的 Rht-Bl等位基因，优选地，该Rht-Bl等位基因是纯合的。在一些实施方案中，该小麦植物包 含选自 Rht-Blc. 1、Rht-Blc. 2、Rht-Blc. 3、Rht-Blc. 4、Rht-Blc. 5、Rht-Blc. 6、Rht-Blc. 7、 Rht-Blc. 8、Rht-Blc. 9、Rht-Blc. 10、Rht-Blc. 12、Rht-Blc. 15、Rht-Blc. 16、Rht-Blc. 17、 Rht-Blc. 18、Rht_Blc. 21、Rht_Blc. 22、Rht_Blc. 23、Rht_Blc. 24、Rht_Blc. 26、Rht_Blc. 27、 Rht-Blc. 28、Rht-Blc. 29、Rht-Blc. 30 和 Rht-Blc. 32 的 Rht-BI 等位基因，并且优选地，该等 位基因是纯合的。在一些优选实施方案中，该小麦植物包含选自Rht-Blc. 22、Rht-Blc. 23、 Rht-Blc. 24和Rht-Blc. 26的Rht-Bl等位基因，并且优选地，该等位基因是纯合的。在一个 实施方案中，所述Rht-Bl多肽包含N端结构域和C端结构域，其中该C端结构域的氨基酸 序列与SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸具有至少98%的同一性，并且其中所述Rht-Bl多 肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的不同之处在于至少⑴SEQ ID NO :5的49和 50位氨基酸之间插入了一个或更多个氨基酸，和（ii)该C端结构域中相对于SEQ ID NO: 5的50-621位氨基酸的一个或更多个氨基酸替换。SEQ ID NO :5示出了长度为621个氨基 酸的野生型小麦Rht-Bla蛋白的氨基酸序列，其由小麦中的野生型Rht-Bla等位基因编码 并且在本文中用作野生型Rht-Bl多肽的参照序列。
[0048] 或者，变体Rht-Bl多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的不同之处在于 至少SEQ ID NO :5的约49和50位氨基酸之间插入了一个或更多个氨基酸，并且编码变体 Rht-Bl多肽的Rht-Bl等位基因的核苷酸序列与SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的不同之处 至少在于存在位于或邻近内含子剪接位点的突变，从而使Rht-Bl等位基因 RNA转录物的内 含子剪接受到影响。本文使用的"内含子剪接位点"指跨越内含子接点的4个核苷酸，即内 含子接点5'侧的2个核苷酸和3'侧的2个核苷酸。本文使用的"邻近内含子剪接位点"指 内含子剪接位点5'侧的3个核苷酸和3'侧的3个核苷酸。SEQ ID NO :1示出了来源于小 麦品种Maringa遗传背景的Rht-Blc等位基因蛋白质编码区的核苷酸序列，其以翻译起始 ATG开始直到翻译终止密码子TGA。SEQ ID NO :1包含插入到Rht-Bl基因中形成Rht-Blc 等位基因的2026个核苷酸的逆转录转座子插入物（核苷酸148-2173) (Wu等，2011)。在该 实