况，每个突变体均包含在这些不同大麦基因的开放阅读框中的突 变。这种不存在表明突变仅在氨基酸改变损害蛋白质功能，导致表型改变时获得。第三，鉴 定的突变几乎总是涉及保守的氨基酸残基。例如，除仅有的两个或三个例外之外，谷类物种 和分类学上远距的拟南芥之间的DELLA突变涉及相同的氨基酸残基。这可见于图8中，其 示出了对小麦Rht-Bla和拟南芥GAI蛋白的比对，并显示出两个序列之间保守的相同氨基 酸。与改变保守性差的残基相比，替换高度保守的氨基酸残基将更可能导致蛋白质活性的 功能破坏。第四，在大麦中、大麦和小麦之间以及小麦中，独立的诱变处理提供了相同突变 的实例，并因而诱导相应的相同氨基酸替换。第五，在杂交和随后的分离之后，在完成连锁 研宄时，在突变表型和突变基因序列之间总是观察到100%连锁。
[0202] 过度生长等位基因增强GA信号传导，因而最可能降低DELLA蛋白的量或其功能活 性，后者可能涉及其与另一些蛋白质的相互作用。在差别剪接的一些情况下，仍然可能产生 具有不同框内氨基酸插入物的DELLA蛋白。例如，突变体偶然产生比Rht-Blc蛋白中的30 氨基酸插入物更长或更短的插入物。如果氨基酸替换导致对GA-GIDl复合物或F盒亚基具 有更强亲和力的话，则其可导致DELLA蛋白降解增加。随机改变不可能增强蛋白质相互作 用，但是利用有效的突变体筛选仍可获得极其罕见的事件。之前通过抗体方法来尝试确定 DELLA蛋白在小麦植株不同部分中的含量是不成功的（Pearce等，2011)。本发明人认为更 可能的是按照上文所述产生的突变DELLA蛋白对其他相互作用蛋白伴侣的亲和力降低。大 量的氨基酸替换发生在LHRl基序中，其为在拟南芥中涉及与PIF4和PIL5相互作用的区域 (de Lucas等，2008 ;Feng等，2008)。相对于大麦中的α-淀粉酶产生，特定过度生长等位 基因对生长的不同影响表明不同的DELLA蛋白区与不同的蛋白伴侣相互作用以调控这两 种响应。
[0203] 未预期到的是，几乎所有经鉴定的过度生长突变均位于单个基因中，尤其是已经 被证明在控制和田间两种条件下对控制多种植物物种生长至关重要的基因。DELLA编码基 因的新等位基因在小麦和大麦两者中的优势强调了该基因在控制生长方面的重要性。例 如，在GA生物合成矮化的过度生长衍生株中，不考虑分析的突变数目，未鉴定出可能增加 活性GA含量的突变，例如GA分解代谢基因的突变。在小麦中成功分离出很多新的突变源 于以下事实：由半显性等位基因（例如Rht-Blc)导致的矮化性实际上是一种二倍体性状， 仅涉及三个基因组中的一个。这使得能够筛选多种丧失功能（相对于Rht-Blc)的衍生等 位基因，其中很多涉及基因内二次突变。
[0204] 在两种物种中，获得农业上重要性状（即植株高度）的新等位基因。此外，在另一 些GA影响的性状中观察到一些变化，其中一些具有实际益处。在无需补充GA的情况下，在 大麦中同时观察到谷粒尺寸变大和α-淀粉酶产生增加。认为这两个性状是有用的，例如 分别用于改善早期幼苗活力和改善制麦芽性能。大的小麦突变体集合包括矮化程度范围超 过现有Rht-I半矮化等位基因的矮化程度范围的突变体，预期其在将特定等位基因靶向特 定环境方面具有价值（Flintham等，1997)。还在具有实际重要性的另一些GA性状中观察 到大量变化，例如相对于Rht-I纯合的植物增加的胚芽鞘长度和相对于Rht-Bla或Rht-Blb 纯合的植物增加的谷粒休眠。这些等位基因应该充当向育种品系中引入性状组的主要遗传 决定簇，所述引入过程通过可用于该基因的最佳分子标记加速。
[0205] DELLA基因在多种物种中是高度保守的。小麦Rht-Bla蛋白与拟南芥GAI蛋白之 间的序列比较示于图8中。可以看出，不同物种的这些蛋白质序列之间存在大程度的同一 性。重要的是，在小麦过度生长突变体中发现的20个氨基酸替换中，除两个或三个之外，全 部位于由小麦和拟南芥基因编码的多肽之间的保守氨基酸中。这强烈地支持了在多种物种 中，位于DELLA蛋白中这些特定位置的残基对活性特别重要。
[0206] 表1 :大麦品系、基因型和突变
[0207]
【主权项】
1. 小麦植物，其包含编码Rht-Bl多肽的Rht-Bl等位基因，所述多肽包含N端结构域 和C端结构域，其中所述C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸具有 至少98%的同一性，并且其中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的 不同之处在于至少（i)在SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间插入了一个或更多个氨基 酸，和（ii)所述C端结构域中相对于SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸的一个或更多个氨 基酸替换。
2. 小麦植物，其包含编码Rht-Bl多肽的Rht-Bl等位基因，所述多肽包含N端结构域和 C端结构域，其中所述C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸具有至 少98%的同一性，其中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的不同之 处在于至少在SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间插入了一个或更多个氨基酸，并且其 中所述Rht-Bl等位基因的核苷酸序列与SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的不同之处至少在 于存在内含子剪接位点突变。
3. 权利要求1或2所述的小麦植物，其中当植物在相同条件下生长时，所述小麦植物相 对于Rht-Blc等位基因纯合的小麦植物具有增加的植株高度并且相对于Rht-Bla等位基因 纯合的小麦植物具有降低的高度。
4. 权利要求1至3中任一项所述的小麦植物，其中所述植物相对于Rht-Blc等位基因 纯合的小麦植物具有增强的能育性和/或产生增加的谷粒产量。
5. 权利要求4所述的小麦植物，其中所述谷粒产量与Rht-Blb等位基因纯合的小麦植 物大致相同或者比其更高。
6. 权利要求1至5中任一项所述的小麦植物，其相对于Rht-Blc等位基因纯合的小麦 植物具有增加的胚芽鞘长度，并且其中所述胚芽鞘长度为Rht-Bla等位基因纯合小麦植物 之胚芽鞘长度的80 %至100%，优选85 %至100%。
7. 权利要求1至6中任一项所述的小麦植物，其能够产生与从Rht-Bla等位基因纯合 的小麦植物获得之谷粒相比休眠增加的谷粒。
8. 权利要求1至7中任一项所述的小麦植物，其中所述Rht-Bl多肽在所述N端结构域 中包含有相对于SEQ ID NO :5的1至49位氨基酸的一个或更多个氨基酸替换。
9. 权利要求1至8中任一项所述的小麦植物，其中所述在SEQ ID NO :5的49和50位 氨基酸之间插入一个或更多个氨基酸为插入约30个氨基酸，其序列优选为DSATPPDAPLVAA AGLAANETTHIKISANK(SEQ ID N0:14)或其变体，其中所述变体的序列与SEQ ID N0:14的不 同之处在于不超过5个氨基酸的氨基酸替换、插入或缺失。
10. 权利要求1或3至9中任一项所述的小麦植物，其中所述Rht-Bl多肽C端结构 域中的一个或更多个氨基酸替换包括参照SEQ ID NO :5的氨基酸G260、V264、A271、G298、 A299、A305、A310、P344、L346、G377、P394、R514、T524、S528、G563、V286、D371、A310、E579、 S493、R283、R271、G274、A280、V234、R484、V285、G230、S488 或 C240 的替换。
11. 根据权利要求10所述的小麦植物，其中所述替换选自G260E、V264M、A271T、G298D、 A299T、A305T、A310V、P344S、L346F、G377R、P394L、R514H、T524I、S528F、G563D、V286M、 D371N、A310T、E579K、S493F、R283H、R271H、G274D、A280T、V234M、R484H、V285F、G230E、S488F 和 C240Y。
12. 权利要求1或3至11中任一项所述的小麦植物，其中所述Rht-Bl等位基因包 含相对于SEQ ID NO :1的序列变化，所述序列变化选自G2715A、G2726A、G2747A、G2829A、 G2831A、G2849A、C2865T、C2966T、C2972T、G3065A、C3117T、G3477A、C3507T、C3519T、G3624A、 G2792A、CC2108TA、G3047A、G2864A 和 G3671A。
13. 权利要求2至11中任一项所述的小麦植物，其中所述Rht-Bl等位基因包含相对于 SEQ ID N0:1 的序列变化，所述序列变化选自 G148A、G148T、G147A、G2084A*G2083A。
14. 权利要求1至13中任一项所述的小麦植物，其对所述Rht-Bl等位基因是纯合的。
15. 权利要求1至14中任一项所述的小麦植物，其具有小麦品种Maringa以外的遗传 背景。
16. 用于产生小麦谷粒的方法，所述方法包括（i)种植如权利要求1至15中任一项所 述的小麦植物，优选在田间作为至少1000株此类植物的群体的一部分或者在至少1公顷的 区域中以标准种植密度种植，和（ii)从所述植物收获谷粒。
17. 用于产生小麦谷粒仓的方法，所述方法包括a)收割根据权利要求1至15中任一项 所述的小麦植物的地上部分，b)脱粒和/或簸扬所述小麦植物部分以使谷粒与所述植物部 分的其余部分分离，以及c)筛分和/或分选步骤b)中所分离的谷粒，并将经筛分和/或分 选的谷粒装入仓中，由此产生谷粒仓。
18. 由权利要求1至15中任一项所述的小麦植物获得的小麦谷粒或通过权利要求16 或17所述的方法产生的小麦谷粒，其包含所述Rht-Bl等位基因。
19. 小麦谷粒，其包含编码Rht-Bl多肽的Rht-Bl等位基因，所述多肽包含N端结构域 和C端结构域，其中所述C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸具有 至少98%的同一性，并且其中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的 不同之处在于至少（i)在SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间插入了一个或更多个氨基 酸，和（ii)所述C端结构域中相对于SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸的一个或更多个氨 基酸替换。
20. 小麦谷粒，其包含编码Rht-Bl多肽的Rht-Bl等位基因，所述多肽包含N端结构域 和C端结构域，其中所述C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸具有 至少98%的同一性，其中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的不同 之处在于至少在SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间插入了一个或更多个氨基酸，并且 其中所述Rht-Bl等位基因的核苷酸序列与SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的不同之处至少 在于存在内含子剪接位点突变。
21. 权利要求19或20所述的小麦谷粒，当将所述谷粒播种到土壤中时，其能够生长成 小麦植物，当植物在相同条件下生长时，所述植物相对于Rht-Blc等位基因纯合的小麦植 物具有增加的高度并且相对于Rht-Bla等位基因纯合的小麦植物具有降低的高度。
22. 权利要求19至21中任一项所述的小麦谷粒，当将所述谷粒播种到土壤中时，其能 够生长成小麦植物，其中所述植物相对于Rht-Blc等位基因纯合的小麦植物具有增强的能 育性和/或产生增加的谷粒产量。
23. 权利要求22所述的小麦谷粒，其中所述谷粒产量与Rht-Blb等位基因纯合的小麦 植物大致相同或者比其更高。
24. 权利要求19至23中任一项所述的小麦谷粒，当将所述谷粒播种到土壤中时，其能 够生长成小麦植物，所述植物相对于Rht-Blc等位基因纯合的小麦植物具有增加的胚芽鞘 长度。
25. 权利要求19至24中任一项所述的小麦谷粒，其与从Rht-Bla等位基因纯合小麦植 物获得之谷粒相比具有增加的休眠。
26. 权利要求19至25中任一项所述的小麦谷粒，其特征还在于根据权利要求8至15 中任一项所述的小麦植物的特征。
27. 权利要求19或20所述的小麦谷粒，已对其进行加工从而使其不再能够萌发，优选 地所述谷粒为经粗磨、破裂、煮半熟、辊压、抛光、粉碎或研磨的谷粒。
28. 小麦细胞，其包含编码Rht-Bl多肽的Rht-Bl等位基因，所述多肽包含N端结构域 和C端结构域，其中所述C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸具有 至少98%的同一性，并且其中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的 不同之处在于至少（i)在SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间插入了一个或更多个氨基 酸，和（ii)所述C端结构域中相对于SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸的一个或更多个氨 基酸替换。
29. 小麦细胞，其包含编码Rht-Bl多肽的Rht-Bl等位基因，所述多肽包含N端结构域 和C端结构域，其中所述C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸具有 至少98%的同一性，其中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的不同 之处在于至少在SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间插入了一个或更多个氨基酸，并且 其中所述Rht-Bl等位基因的核苷酸序列与SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的不同之处至少 在于存在内含子剪接位点突变。
30. 权利要求28或29所述的小麦细胞，其特征还在于如权利要求8至15中任一项所 限定的特征。
31. 核酸分子，其编码Rht-Bl多肽，所述多肽包含N端结构域和C端结构域，其中所述 C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸具有至少98%的同一性，并且 其中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的不同之处在于至少（i)在 SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间插入了一个或更多个氨基酸，和（ii)所述C端结构 域中相对于SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸的一个或更多个氨基酸替换。
32. 核酸分子，其编码Rht-Bl多肽，所述多肽包含N端结构域和C端结构域，其中所述 C端结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸具有至少98 %的同一性，其 中所述Rht-Bl多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的不同之处在于至少在SEQ ID NO :5的49和50位氨基酸之间插入了一个或更多个氨基酸，并且其中所述Rht-Bl等位基 因的核苷酸序列与SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的不同之处至少在于存在内含子剪接位点 突变。
33. 权利要求31或32所述的核酸分子，其特征还在于如权利要求8至15中任一项所 限定的特征。
34. 权利要求31至33中任一项所述的核酸分子，其在细胞中，优选在小麦细胞例如小 麦胚乳细胞中，或者在食物产品中。 35. Rht-Bl多肽，其包含N端结构域和C端结构域，其中所述C端结构域的氨基酸序列 与SEQ ID NO :5的50-621位氨基酸具有至少98%的同一性，并且其中所述Rht-Bl多肽的 氨基酸序列与SEQ ID NO :5所示序列的不同之处在于至少（i)在SEQ ID NO :5的49和50 位氨基酸之间插入了一个或更多个氨基酸，和（ii)所述C端结构域中相对于SEQ ID NO :5 的50-621位氨基酸的一个或更多个氨基酸替换。
36. 权利要求35所述的多肽，其特征还在于如权利要求8至11中任一项所限定的特 征。
37. 权利要求35或36所述的多肽，其在细胞中，优选在小麦细胞例如小麦胚乳细胞中， 或者在食物广品中。
38. -种产生小麦粉、全麦面粉、淀粉、淀粉颗粒或麸的方法，所述方法包括获得权利要 求18至27中任一项所述的谷粒并对所述谷粒进行加工以产生所述面粉、全麦面粉、淀粉、 淀粉颗粒或麸。
39. 小麦粉、全麦面粉、淀粉、淀粉颗粒或麸，其通过权利要求38所述的方法产生或者 包含权利要求31至34中任一项所述的核酸分子和/或根据权利要求35至37中任一项所 述的多肽。
40. 生产食物产品的方法，所述方法包括将权利要求18至27中任一项所述的谷粒或权 利要求39所述的小麦粉、全麦面粉、淀粉、淀粉颗粒或麸与至少一种另外的食物成分混合 以生产所述食物产品。
41. 生产淀粉的方法，所述方法包括获得权利要求18至27中任一项所述的谷粒，并对 所述谷粒进行加工以生产淀粉。
42. 生产乙醇的方法，所述方法包括发酵从权利要求18至27中任一项所述的谷粒获得 的淀粉，由此生产所述乙醇。
43. 饲养动物的方法，所述方法包括向所述动物提供权利要求1至15中任一项所述的 小麦植物、权利要求18至27中任一项所述的小麦谷粒、权利要求28至30中任一项所述的 小麦细胞或包含权利要求39所述的小麦粉、全麦面粉、淀粉、淀粉颗粒或麸的饲料产品。
44. 食物产品，其包含权利要求1至15中任一项所述的小麦植物或其一部分、权利要求 18至27中任一项所述的小麦谷粒、权利要求28至30中任一项所述的小麦细胞、权利要求 31至33中任一项所述的核酸分子、权利要求35或36中任一项所述的多肽，或者为权利要 求39所述的小麦粉、全麦面粉、淀粉、淀粉颗粒或麸的成分。
45. 权利要求44所述的食物产品，其中所述食物产品为发酵的或未发酵的面包、意大 利面、面条、早餐麦片、点心、蛋糕、糕点或基于面粉的调味品。
46. 对小麦植物或谷粒基因分型的方法，所述方法包括（i)获得包含从小麦植物或谷 粒提取的核酸或蛋白质的样品，和（ii)检测所述样品中根据权利要求32或33所述的核酸 分子或根据权利要求35或36所述的多肽。
47. 权利要求46所述的方法，其中所述小麦植物包含选自以下的Rht-Bl等位基 因：Rht-Blc. 1、Rht-Blc. 2、Rht-Blc. 3、Rht-Blc. 4、Rht-Blc. 5、Rht-Blc. 6、Rht-Blc. 7、 Rht-Blc. 8、Rht-Blc. 9、Rht-Blc. 10、Rht-Blc. 12、Rht-Blc. 15、Rht-Blc. 16、Rht-Blc. 17、 Rht-Blc. 18、Rht_Blc. 21、Rht_Blc. 22、Rht_Blc. 23、Rht_Blc. 24、Rht_Blc. 26、Rht_Blc. 27、 Rht-Blc. 28、Rht-Blc. 29、Rht-Blc. 30 和 Rht-Blc. 32。
48. 从小麦植物群中选择小麦植物的方法，所述方法包括：i)使用权利要求46或47所 述的方法对所述小麦植物群中的每个植物进行基因分型，其中所述植物群通过两种植物之 间的杂交获得，所述两种植物中至少一种植物为根据权利要求1至15中任一项所述的小麦 植物，和（ii)基于基因分型选择所述小麦植物。
49. 将Rht-Bl等位基因导入缺乏所述等位基因的小麦植物中的方法，所述方法包括： i) 将第一亲本小麦植物与第二亲本小麦植物杂交，其中所述第二植物为根据权利要求 1至15中任一项所述的小麦植物，和 ii) 将步骤i)的杂交后代植物和与所述第一亲本植物具有相同基因型的植物回交以 产生具有所述第一亲本的大部分基因型但包含所述Rht-Bl等位基因的植物。
50. 根据权利要求48所述的方法，其中使用权利要求46或47所述的方法，针对是否存 在所述等位基因对所述后代植物进行基因分型。
51. -种交易小麦谷粒的方法，所述方法包括（a)获得权利要求18至27中任一项所述 的谷粒，其任选地包括以下步骤 (i) 培植根据权利要求1至15中任一项所述的植物，并从所述植物收获谷粒， (ii) 将所述谷粒放置于容器中和/或储存所述谷粒，和/或 (iii) 将所述谷粒运输至不同的地点， 以及（b)为了金钱利益交易所述获得的谷粒。
52. 分离的寡核苷酸，其包含根据权利要求31至34中任一项所述的多核苷酸中的至少 19个连续核苷酸或者与其完全互补，其中所述19个连续核苷酸包括参照SEQ ID NO :1的 选自 G2715A、G2726A、G2747A、G2829A、G2831A、G2849A、C2865T、C2966T、C2972T、G3065A、 C3117T、G3477A、C3507T、C3519T、G3624A、G2792A、CC2108TA、G3047A、G2864A、G3671A、 G148A、G148T、G147A、G2084A 和 G2083A 的至少一个核苷酸替换。
53. 权利要求31至34中任一项所述的核酸分子，其与能够指导所述核酸分子在植物细 胞中表达的启动子有效连接，或者其在载体或宿主细胞中。
54. -种转基因植物，其包含含有权利要求31至34中任一项所述的核酸分子的转基 因，或其包含所述核酸分子的后代植物。
【专利摘要】本发明提供了小麦植物，其包含编码Rht-B1(DELLA)多肽的Rht-B1等位基因。对来自包含Rht-B1矮化等位基因的近等基因小麦品系的谷粒进行叠氮化钠诱变。选择与矮化亲本相比表现出更高的早期叶伸长速率或成熟植株高度的植物并对Rht-B1基因进行测序。这样鉴定出35个突变的Rht-B1c等位基因。利用类似的方法鉴定大麦中slnld矮化等位基因的突变等位基因，其中DELLA由sln1基因编码。
【IPC分类】C12N15-29, A01H5-00
【公开号】CN104837335
【申请号】CN201380049952
【发明人】彼得·迈克尔·钱德勒, 卡罗尔·安妮·哈丁
【申请人】联邦科学和工业研究组织, 谷物研究开发公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2013年8月22日
【公告号】CA2882756A1, EP2894967A1, US20150257353, WO2014028980A1