1);1?621(美国专利号 6,040,506);1?622(美国专利号 6,040,507);01邢12(美国 专利号 6,040,508);1?740(美国专利号 6,043,416);79314附（美国专利号 6,043,417); 17INI20(美国专利号6,043,418) ;17DHD7(美国专利号6,046,387) ;83INI8(美国专利号 6,046,388) ;83InI14(美国专利号 6,046,389) ;01INL1(美国专利号 6,046,390); LH286 (美国专利号6,049,030) ;ASG29 (美国专利号6,054,640) ;ASG07 (美国专利号6， 060,649)山11111(美国专利号6,069,303);0905〇1(美国专利号6,072，108) ;兀尺顺113(美 国专利号6,072，109);即2029(美国专利号6,072，110)洫5609(美国专利号6,077,996); PHOWE(美国专利号6,077,997) ;86AQV2(美国专利号6,077,999) ;PH1GG(美国专利号6， 080,919) ;RPK7346(美国专利号 6,506,965) ;NP2044BT(美国专利号 6,573,438); PH8W4(美国专利号6,600,095) ;M42618(美国专利号6,617,500) ;MV7100(美国专利号6， 624,345);3开286(美国专利号 6,627,800)出￡4207(美国专利号 6,632,986);(：19805(美 国专利号6,632,987);兀1?503(美国专利号6,635,808) ;顺401(美国专利号6,635,809); 4￥卩500(美国专利号6,635,810);7511385(美国专利号6,642,440);1(14773(美国专利号6， 642,441) ;咿2073(美国专利号 6,646，187)丨54104(美国专利号 6,646，188);5乂11755(美 国专利号 6,653,536) ;1445-008-1(美国专利号 6,653,537) ;NP2015(美国专利号 6,657， 109);7511383(美国专利号 6,660,916);1^310(美国专利号 6,664,451);18805(美国专利 号 6,670, 531) ;RR728-18 (美国专利号 6,677, 509) ;LH320 (美国专利号 6,683, 234); 11084811(美国专利号6,686,519);160028(美国专利号6,686,520)屮1110)(美国专利号6， 693,231) ;诎295(美国专利号 6,693,232)^18(：(美国专利号 6,700，041)屮114￥6(美国 专利号6,706,954);咿2276(美国专利号6,706,955);咿2222(美国专利号6,710,233); PhOR8(美国专利号6,717,036) ;PH581(美国专利号6,717,037) ;PH6WR(美国专利号6， 717,038) ;PH5HK(美国专利号 6,717,039) ;PH5W4(美国专利号 6,717,040) ;PH0KT(美国专 利号 6,720,486) ;PH4GP(美国专利号 6,720,487) ;PHJ8R(美国专利号 6,723,900); NP2052(美国专利号6,723,901) ;PH7CP(美国专利号6,723,902) ;PH6WG(美国专利号6， 723,903);?册纽（美国专利号6,727,412);4?33339(美国专利号5,489,744)屮11疆5(美国 专利号 5,491，286) ;LH225(美国专利号 5,491，293) ;LH185(美国专利号 5,491，294); LH176(美国专利号5,491，296) ;PHW06(美国专利号5,495,065) ;LH252(美国专利号5， 495,067)山11231(美国专利号5,495,068)屮1^^4(美国专利号5,495,069)屮册38(美国专 利号5,506,367)丨圆82(美国专利号5,506,368)屮1^)5(美国专利号5,527,986) ;899(美 国专利号5,530，181)丨祖?1(美国专利号5,530，184)丨1?13(美国专利号5,534,661) ; CG00653(美国专利号5,536,900) ;PHRD6(美国专利号5,541，352) ;PHK46(美国专利号5， 543,575)屮耶64(美国专利号5,545,809)山11189(美国专利号5,545,811)屮圆12(美国专 利号 5, 545,812) ;PHRF5 (美国专利号 5, 545,813) ;PHFR8 (美国专利号 5, 545,814); PHN18 (美国专利号5, 557,034) ;PHTP9 (美国专利号5, 557,038) ;PH54B(美国专利号5， 563,320)屮邪?5(美国专利号5,563,321)屮撤66(美国专利号5,563,322)屮撤?9(美国专 利号 5, 563, 323) ;PHBE2 (美国专利号 5, 563, 325) ;ZS0510 (美国专利号 5, 563, 327); ?祖六0(美国专利号5,602,317)山11273(美国专利号5,880,348);7571 (美国专利号5,880， 349)山11237(美国专利号5,880,350);?110财（美国专利号5,889，188) ;?￡85(美国专利号 5,902,922);8卩286(美国专利号5,905，191);3六2六1(美国专利号5,910,625);910卩六-5(美 国专利号5,910,635) ;ASG20(美国专利号5,910,636) ;ZS03940(美国专利号5,912， 420) ;91ISI6(美国专利号 5,912,421) ;MF1113B(美国专利号 5,914,452) ;PH03D(美国专 利号 5,917,125) ;PHDN7 (美国专利号 5,917,134) ;01DIB2 (美国专利号 5,920,003); 82DHB1 (美国专利号5,922,935) ;8M222(美国专利号5,922,936) ;PHMJ2(美国专利号5， 929,313) ;SBB1(美国专利号 5,932,787) ;86ISI3(美国专利号 5,932,788) ;ZS01231(美国 专利号 5,936，144);870从4(美国专利号 5,936，145);7931(^2(美国专利号 5,936，146); PHlGC(美国专利号5,936,148) ;01DHD10 (美国专利号5,939,606) ;PH2CB(美国专利号5， 939,607)#11080(美国专利号5,939,608);?11141'(美国专利号5,942,670) ;?11185(美国专 利号 5,942,671) ;PH19V(美国专利号 5,948,957) ;ZS09247(美国专利号 5,952,551); CRAUGSH2W-89(美国专利号 5,952,552) ;91DHA1 (美国专利号 5,962,770) ;LH300(美国专 利号 5,965,798) ;91ISI4(美国专利号 5,965,799) ;79103A1 (美国专利号 5,969,212); ASG22 (美国专利号5,969, 220) ;82IUH1 (美国专利号5,969, 221);(美国专利号5,969， 222);1^302(美国专利号5,973,238)山11265(美国专利号5,973,239)屮册14(美国专利号 5,977,451) ;01IBH10(美国专利号 5,977,452) ;91CSI-1(美国专利号 5,977,453); WKBC5(美国专利号5,977,455) ;PH1M7(美国专利号5,977,456) ;R327H(美国专利号6， 399,860)丨1?2108(美国专利号6,407,320)丨1?3383(美国专利号6,410,830) ;几302(美国 专利号 6,414,227) ;FR3303(美国专利号 6,414,228) ;9034(美国专利号 6,420,634); 61500(美国专利号6,420,635)丨1?3311(美国专利号6,420,636);1389972(美国专利号6， 420,637) ;PH77C(美国专利号 6,423,888) ;IT201(美国专利号 6,426,451) ;G3000(美国专 利号 6,426,453) ;94INK1B(美国专利号 6,429,363) ;PH3HH(美国专利号 6,433,259); 6TR512 (美国专利号6,433, 260) ;89AHD12 (美国专利号6,433, 261) ;1889291 (美国专利号 6,433,262);207081'(美国专利号 6,437,223);3323(美国专利号 6,437,224);61900 (美 国专利号 6,441，279) ;16IUL6(美国专利号 6,441，280) ;7RN401(美国专利号 6,444,881); UBB3(美国专利号6,444,882) ;6077(美国专利号6,444,883) ;1014738(美国专利号6， 444,884)汀0(：1(美国专利号 6,452,074);6?6151(美国专利号 6,452,075);7180(美国专 利号 6,452,076) ;WQDS7 (美国专利号 6,455, 764) ;X532Y(美国专利号 6,459,021); 1465837 (美国专利号 6,459,022) ; 1784S(美国专利号 6,469, 232) ;LH176Bt810 (美国专利 号 6,469,233) ;6RC172(美国专利号 6,469,234) ;3327(美国专利号 6,469,235); 7SH382(美国专利号6,476,298) ;1181664(美国专利号6,476,299) ;NP2010(美国专利号 6,483,014) ;FR3361 (美国专利号 6,483,015) ;1778S(美国专利号 6,486,386); 1362697(美国专利号6,492,581);1^1(7250(美国专利号6,506,964) ;和61^321(美国专利 号 6,911，588)。
[0192] 此处所述的术语"包括"是指"包括但不限于"。
[0193] 本文包括下面的实施例来证明本发明的某些优选实施方案的实施例。本领域的技 术人员应该理解，下面的实施例中公开的技术代表了本发明人发现在实施本发明中运用良 好的技术，因此可以被认为是构成实施本发明的优选方式的实施例。然而，本领域的技术人 员根据本公开内容应该理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的具体 实施方案进行许多改变，而且仍然获得相同或类似的结果。
【具体实施方式】
[0194] 实施例1:玉米的转化及MON87427事件筛选
[0195] 通过农杆菌介导的玉米转化方法产生玉米植物MON87427。将玉米细胞转化并再 生成完整的玉米植物，从表现出转基因表达盒的完整性和对草甘膦的耐受性的植物群落中 筛选单个植物。从该群落中筛选和鉴定玉米植物事件MON87427。
[0196] 利用转化载体PM0N58401通过农杆菌介导的玉米未成熟胚胎的转化方法开发转 基因草甘膦耐受的玉米植物MON87427。MON87427的转基因插入序列和表达盒包含含重 复增强子区域（P-e35S)的花椰菜花叶病毒（cauliflowermosaicvirus，CaMV) 35S的启动 子和前导序列（leader);可操作地连接至源自玉米热休克蛋白70基因的第一个内含子的 DNA前导序列（I-HSP70);可操作地连接至编码源自拟南芥（Arabidopsisthaliana)EPSPS 的shkG基因的N端叶绿体转运肽的DNA分子（TS-CTP2);可操作地连接至源自农杆菌属 CP4菌株的aroA基因并编码CP4EPSPS蛋白的DNA分子；可操作地连接至源自根瘤农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)胭脂氨酸合成酶（T-NOS)的 3'UTRDNA分子。
[0197] 可以通过许多方法转化玉米细胞。例如，可以使用下列方法产生包含本发明的植 物表达盒的转基因玉米植物。包含植物表达盒的根瘤农杆菌的液体培养从甘油储液或从新 鲜划线平板开始，在PH7. 0、含50mg/l(每升毫克数）卡那霉素和或50mg/l链霉素或50mg/ 1奇霉素和25mg/l氯霉素以及200yM乙酰丁香酮（AS)的液体LB培养基中26°C-28°C 振摇（约每分钟150转，rpm)生长过夜达到指数生长期。将农杆菌细胞重悬于接种培养 基（如美国专利6, 573, 361的表8中所述的液体CM4C)，调整细胞密度以便当在分光光度 计中660nm(即OD66tl)测定时重悬的细胞的光密度为1。新鲜分离的未成熟的玉米胚胎用 农杆菌接种并在23°C暗处共培养2-3天。然后将胚胎转移至补充有500mg/l羧苄青霉素 (Sigma-Aldrich，StLouis，M0)和 20yMAgNO3的延迟培养基（N61-100-12 ;如美国专利 5， 424,412的表1中所述）并在28°C培养4-5天。随后所有的培养都保持在该温度下。
[0198] 然后将胚胎转移至补充有500mg/l羧苄青霉素和0. 5mM草甘膦的第一筛选培养基 (N61-0-12 ;如美国专利5,424,412的表1中所述）。两周后，将存活的组织转移至补充有 500mg/l羧苄青霉素和I.OmM草甘膦的第二筛选培养基（N61-0-12)。存活的愈伤组织在 LOmM草甘膦条件下传代培养，传代培养3次，每次间隔两周。当鉴定草甘膦耐受组织时， 组织膨大再生。对于再生，将愈伤组织转移至补充有0.IUM脱落酸（ABA;Sigma-Aldrich， StLouis，MO)的再生培养基（MS0D，如美国专利5,424,412的表1中所述）并培养两周。 将再生愈伤组织转移至高蔗糖培养基并培养两周。将小植株转移至在培养屏中的MSOD培 养基（无ABA)并培养两周。筛选具有正常表型特征的生根的植物并转移至土壤用于生长 及进一步评价。将通过上述转化而产生的RO植物转移到土壤中用于生长，然后自交产生Rl 种子。通过分析技术（包括TaqMaruPCR分析和除草剂喷洒）的组合筛选植物。
[0199] 基于显示事件的优势表型和分子特征及其期望的单倍体相关性从45个单独转基 因事件中筛选MON87427事件（Cr9,60cM)。事件MON87427的筛选过程以代表45个RO 事件的转化的玉米植物开始。这些用草甘膦（在V7期64盎司/英亩）喷洒，然后评价营养 耐受性和草甘膦喷洒后的不育性。在初始的45个事件中，当用测试的草甘膦速率和时机喷 洒时，35个RO事件表现出营养草甘膦耐受性并且是雄性不育的。然后将这些35个RO事件 的植物继续进行进一步的分子分析鉴定。用Taqman? _PCR分析和Southern印迹分析， 分子鉴定了35个事件。在分析的35个事件中，挑选了29个事件用于进一步的田间测试。 然后在田间效率和产量的田间试验中分析了29个Rl事件。此外，进行了额外的分子鉴定， 包括基因组和蛋白表达鉴定。分析数据，从广泛的Rl植物分析和田间试验结果中挑选了3 个重要事件进行R2田间试验。3个重要事件的进一步分析和试验导致了事件MON87427的 筛选。
[0200] 额外的田间筛选包括在营养4生长期（V4)和营养10生长期（VlO)用草甘膦以32 盘司 / 英亩（Roundup-Ult_raK ,MonsantoCo.，St.Louis，MO)处理事件MON87427。在V4 喷洒后对阳性和阴性的植物计数。在V4和VlO喷洒后的处理后（DAT) 10-14天对处理植物 的萎黄病和畸形进行计数。也对V4和VlO喷洒的植物进行开花期穗不育率进行计数。
[0201] 实施例2 :M0N87427DNA序列的鉴定
[0202] 通过详细的分子分析方法鉴定插入玉米植物MON87427基因组的DNA和侧翼基因 组序列。这些分析包括：对转基因插入DNA和在转基因插入序列侧翼的基因组DNA测序，测 定转基因插入数（在玉米基因组中整合位点数），测定拷贝数（一个位点中转基因DNA的拷 贝数），分析插入基因盒的完整性，分析在插入序列侧翼的基因组DNA和插入和玉米基因组 的单倍体区域的关联。
[0203] 用PCR技术测定MON87427中转基因DNA插入的侧翼的序列。从来自标准温室 条件下生长的组织的转基因系分离植物基因组DNA。将植物组织与液氮混合并用研钵和研 杵研磨成精细粉末。根据厂商的操作步骤用Nucleon?PhytoPure?基因组DNA提取试剂 盒（RPN8511，Amersham，Piscataway，NJ)提取DNA。在最终的沉淀步骤之后，将DNA重悬于 0.5mlTE(10mMTris-HClpH8.0,ImMEDTA)中。本领域技术人员可以修改该方法以从玉 米的任何组织（包括但不限于种子）中提取DNA。另外，用基于转基因DNA的限制分析选择 的限制性内切酶消化一份DNA。经过限制性片段的自连接后，使用由转基因DNA序列设计的 引物进行PCR，该引物会扩增由转基因DNA的5'和3'端延伸的序列。通过琼脂糖凝胶电泳 分离PCR产物，并使用QIAGEN凝胶纯化试剂盒（Qiagen，Valencia，CA)纯化。直接使用标 准DNA测序方案对随后的DNA产物测序。延伸至表达盒转基因DNA的右边界（RB)序列的 5'侧翼序列如SEQIDNO:7所示。延伸至表达盒转基因DNA的左边界（LB)序列的3'侧 翼序列如SEQIDNO:8所示。完全整合入玉米基因组DNA并包含表达盒DNA的序列如SEQ IDNO:9 所示。
[0204] 将分离的DNA分子序列与转基因DNA序列进行比较以鉴定侧翼序列和共分离的 转基因DNA片段。通过使用基于推导的侧翼序列数据和已知的转基因DNA序列设计的引 物进行PCR以确认表达盒的存在。使用由M0N87427中的侧翼序列设计的引物，分离对 应于转基因DNA整合到转化系中的同一区域的野生型序列。使用Elongase?扩增系统 (Invitrogen，Carlsbad，CA)进行PCR反应。相对于多个核苷酸和蛋白质数据库分析MON87427中的侧翼DNA序列和野生型序列LH198。该信息用于检查转基因与植物基因组的关 联，并观察插入位点的完整性。
[0205] 实施例3 :用于鉴定样品中M0N87427DNA的方法
[0206] 本实施例描述了可用于鉴定样品中事件MON87427DNA的方法。使用事件侧翼序 列、野生型玉米基因组序列和/或转基因序列来设计用于这种方法中的引物和探针。在测 试中可以包括或不包括内部对照引物和探针。
[0207] 描述了鉴定样品中事件MON87427 (事件特异性测试）和/或事件MON87427的 CP4-EPSPS合成基因（a.k.a.CP4-Zm)(事件特异性测试）的端点TAQMAN?热扩增方 法。使用事件侧翼序列、野生型玉米基因组序列和转基因序列来设计用于这些测试中的 引物和探针（表1)。用于事件特异性测试的DNA引物是引物SQ12763(SEQIDN0:17)、 3〇12886(5￡〇10勵：18)和6441^标记的探针？84352(5￡〇10勵 ：19)。用于事件特异性测 试的DNA引物是引物SQ20052(SEQIDN0:11)、SQ20053(SEQIDN0:12)和6-FAM?标记的 探针PB10016(SEQIDNO:13)A-FAMtm是连接到DNA探针上的AppliedBiosystems(Foster City，CA)的荧光染料产品。用于此分析的对照应包括来自包含事件MON87427DNA的玉米 的阳性对照、来自非转基因玉米的阴性对照和不包含模板DNA的阴性对照。
[0208] 此外，PCR反应的可选的对照包括对玉米基因组中单一拷贝基因特异的内部对照 引物和内部对照探针。本领域技术人员知道如何设计对玉米基因组中单一拷贝基因特异的 引物。用于转基因特异性测试中作为内部对照的DNA引物是引物SQ1241(SEQIDN0:14)、 SQ1242(SEQIDN0:15)和VICTAMRA标记的探针PB0084(SEQIDN0:16)。对于转基因特 异性测试，可使用内部对照引物和探针以及可选的下列步骤5-6。对于事件特异性测试，不 使用内部对照。
[0209] 表1:引物和探针
[0210]
[0211]用于端点TAQMAN?方法的条件的例子如下：
[0212] 步骤1 :将18百万欧姆水调节至10y1的最终体积。
[0213] 步骤2:将5. 0y1的2X通用母液混合物（dNTPs、酶、缓冲液）调节至IX最终浓 度。
[0214]步骤 3 ;将 0. 5y1事件引物-1(SEQIDNO: 17)和事件引物-2(SEQIDNO: 18)混 合物（重悬于18百万欧姆水中至每条引物的浓度为20uM)调节至1.0yM最终浓度（例如 在微量离心管中，加入随后物质以获得500y1体积的20uM最终浓度：100yM浓度的事件 引物-1(SEQIDN0:17)100yl;100yM浓度的事件引物-2(SEQIDN0:18)100yl;300yl的18百万欧姆的水）。
[0215]步骤 4:将 0. 2yI事件 6-FAM?MGBProbe(SEQIDNO:19)(重悬浮于 18 兆欧的水 中至IOyM浓度）至0. 2yM最终浓度。
[0216] 步骤5(可选的）：将0. 5y1内部对照引物-1和内部对照引物-2的混合物（重 悬浮于18兆欧的水中至各引物的浓度为20yM)调节至LOyM最终浓度。