一种油茶丰产高接换冠的分子设计方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及使用分子识别技术设计经济林丰产高接换冠的嫁接方法，属于生物技 术领域。
【背景技术】
[0002] 油茶是重要的木本油料植物，是我国特有的经济效益和生态效益倶佳的优良乡土 树种之一，在南方经济林产业中占有十分重要的地位。油茶籽榨取的茶油是联合国粮农组 织重点推广的健康型高级食用油。到2014年底，我国油茶面积已达5095万亩，但现有加工 能力是原料供应量的4倍，为保障国家食用油安全，国家林业局的《全国油茶产业发展规划 (2009-2020)》，到2020年油茶林基地达到7018. 1万亩。
[0003] 我国现有油茶林大多为上世纪60-70年代利用种子实生苗所建，大多单产低，例 如，2008年全国老油茶林平均亩产茶油仅5. 79公斤，急需改造。
[0004] 我国学者对影响油茶坐果和产量的内外因进行了一系列研究，如开花习性（曾燕 如等，浙江林学院学报，2009, 26 (6) : 802-809)、开花授粉特征（王湘南等，中南林业科技 大学学报，2013, 33 (12) : 1-5)、花期气候对坐果率的影响（曾燕如和黎章矩，浙江林学院学 报，2010, 27(3) : 323-328)、授粉授精过程（廖婷等，林业科学，2014, 50(2) : 51-55)、生长调 节剂保花保果、合理栽植、抚育管理、修剪和施肥（陈彦镜，农业和技术，2014,（1) :81-83)、 病虫害防治和林分结构优化（李雁鸣等，安徽农业科学，2013, 41 (33) : 12898-12899)及 嫁接和截干更新等（邓荫伟等，中国林副特产，2013,（6):19-22)。结果表明，自花和 同株异花传粉、树龄过小或过老、品种的优劣、病虫害和机械损伤（舒金平等中国农学通 报，2013, 29(34) :7-11)等是造成油茶落花落果的主要原因。
[0005] 油茶不存在无融合生殖、结实依赖传粉者。油茶自花授粉成果率低于同株异花授 粉（王猛等，安徽农业科学，2012, 40 (6) : 3267-3268)、同株异花授粉成果率又低于异株异 花授粉成果率。油茶冠大、花多，传粉者常在同株不同花间访问，易造成同株异花传粉和自 花传粉，后自交不亲和较易发生，造成落果。对于上世纪营造的老油茶林，种苗来源于种子 实生苗，造林时没有混系造林技术指导生产，多为随机造林，相同或相近基因型较易用于相 邻植株造林，近交（同株异花授粉、自花授粉）更易发生。这也是老油茶林低产的主要原因 之一。尽管通过抚育管理一定程度上提高了老油茶林产量，但由于抚育管理未能改变老油 茶林传粉格局，其低产问题未能获得有效突破。
【发明内容】
[0006] 针对上述问题，本发明通过SSR标记检测Dice遗传系数，再根据结实率和坐果率 选配出最佳授粉组合的Dice遗传系数范围I ;根据嫁接成活率，选出最适嫁接的Dice遗传 系数范围II，Dice遗传系数范围I和Dice遗传系数范围II的共同部分为最适油茶组合的 Dice遗传系数范围；对此Dice遗传系数范围内的油茶进行高异交传粉设计配置，可有效地 降低自交和同株异花授粉发生率，提高异交传粉率，从而保证油茶高产。本发明的技术方案 如下：一种油茶丰产高接换冠的分子设计方法，包括以下顺序的步骤：
[0007] (1)选择不同油茶种质，分别提取其DNA ;
[0008] (2)筛选适用于油茶的SSR标记引物；
[0009] (3)利用筛选出的SSR标记引物，计算不同油茶种质DNA间的Dice遗传系数；
[0010] (4)将Dice遗传系数划分为11个级别；在每个Dice遗传系数级别内，设计油茶 组合；
[0011] (5)根据步骤⑷设计的油茶组合，以两个不同油茶种质互为授粉树，进行人工授 粉；
[0012] (6)根据步骤⑷设计的油茶组合，进行人工嫁接；
[0013] (7)在人工授粉后的第30天统计并计算结实率，第180天统计并计算坐果率；得 到配合力最高的Dice遗传系数范围I ;
[0014] (8)嫁接后第180天统计并计算嫁接成活率，得到嫁接成活率最高的Dice遗传系 数范围II ;
[0015](9)以步骤（7)、步骤⑶得到的Dice遗传系数范围共同部分的油茶为种质材料， 设计油茶丰产高接换冠模式。
[0016] 进一步的，所述步骤（1)提取DNA的方法为改良CTAB法。
[0017] 进一步的，所述步骤（2)筛选SSR标记引物的方法包括如下步骤：
[0018] 1)利用RNA-Seq技术开发油茶的SSR标记序列；
[0019]2)采用Primer Premier 5. 0软件设计特异引物：参数为：引物长度（20~24nt)、 3'端稳定性（-6. 0~-9. Okal/mol)、引物Tm值（55~60°C )、GC含量（45~55% )、引物 rating值> 90。以2个不同油茶优良无性系的DNA为模板，进行PCR扩增，根据聚丙烯酰 胺垂直凝胶电泳结果，筛选出SSR标记引物。
[0020] 进一步的，所述步骤（6)嫁接方法为撕皮嵌接法。
[0021] 进一步的，所述步骤（9)油茶丰产高接换冠模式，油茶的嫁接枝条之间的距离为 0. 31m-0. 75m，油茶种质之间的Dice遗传系数范围为0. 521-0. 570。
[0022] 本发明利用SSR标记检测不同油茶种质间的Dice遗传系数，选配出结实率、坐果 率和嫁接成活率均较高的Dice遗传系数范围为：0. 521-0. 570,结实率、坐果率和嫁接成活 率分别达80%、59%和75%以上，再以高异交传粉配置格局成功实现油茶丰产高接换冠模 式，为我国发展油茶产业提供了低产林改造的技术基础。
[0023] 本发明的有益效果如下：
[0024] (1)本发明的分子识别方法操作简单，易推广扩大使用；
[0025] (2)使用本发明方法提供的分子识别方法，筛选出Dice遗传系数范围 0. 521-0. 570的授粉组合为最佳，异交授粉的结实率、坐果率和嫁接成活率分别达80%、 59%和75%以上。极大的提高了油茶的结实率、坐果率和嫁接成活率；
[0026] (3)本发明提供油茶丰产高接换冠模式，为我国大面积改造低产老油茶林，发展油 茶产业提供了丰产高接换冠的技术基础。
【具体实施方式】
[0027]下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但这不限制本发明的范围，实施例 以玉屏油茶种质基地的49个油茶优良无性系品种为材料，分别为：3-18, 5-35, 5-35-1， 5-35-2,5-36-1，5-36-2,5-36-2,5-37,5-37-2, 5-37-3,5-38,5-39,5-39-2,5-40,5-41， 5- 42,5-42-2, 5-42-3,5-44, 5-44-2-1，5-44-3,5-45-1，5-45-2,5-47, 6-48,6-48-2, 6-49， 6- 53, 6-53-2,6-53-3, 6-54,6-54-1，6-55, 6-57,6-58,6-62, 6-62-2,6-62-3, 6-63, Y-41， Y-44, ZB1，岑软11号，独籽1号，湘210,湘林5号，湘林5,玉屏1，长林27 ;NaAc溶液的浓 度为 3mol/L，PH 为 5. 2〇
[0028] -、选择最佳的油茶授粉组合的Dice遗传系数范围
[0029] (1)以49个油茶优良无性系品种为材料，利用改良CTAB方法分别提取其DNA，步 骤如下：
[0030] 1)将油茶叶片10克放入研钵，倒入适量液氮研磨后，移入预先加有700 iiL 2XCTAB的离心管中，置于65°C水浴处理45~60min，离心（4°C，lOOOrpm，lOmin)获得上清 液I ;
[0031] 2)取步骤1)离心管中上清液I 600 y L于新离心管中，加入总体积为600 y L的 酸、氯仿和异戊醇混合液（体积比为25 :24 :1)，摇勾后离心（4°C，lOOOrpm，lOmin)得上清 液II ;
[0032] 3)取上清液II550 y L于新离心管中，加入500 y L 10XCTAB，摇匀后置于65°C水 浴中溶解2~3min，再加入总体积为50 yL的酸：氯仿：异戊醇混合液（体积比为25 :24 : 1)，摇勾后离心（4°C，lOOOrpm，lOmin)，得上清液III;
[0033] 4)取上清液III加入其体积2倍的无水乙醇，再加入其体积1/10的NaAc溶液，静置 2小时以上，得沉淀；
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