034]5)将步骤4)所得沉淀洗涤后烘干，烘干温度为37°C，时间为8~lOmin;
[0035] 6)将步骤5)烘干后的沉淀溶解后常温静置2小时，即得油茶DNA样品；
[0036] (2)以油茶叶片为材料，以公知任意一种方法提取其RNA，并米用RNA-Seq技术进 行RNA测序，然后根据序列搜索简单重复序列，共检测到8564个SSR标记序列；
[0037] (3)采用Primer Premier 5. 0软件设计特异引物：参数为：引物长度（20~ 24nt)、3'端稳定性（-6. 0 ~-9. Okal/mol)、引物 Tm值（55 ~60°C )、GC 含量（45 ~55% )、 引物rating值> 90。以2个不同油茶种质的DNA为模板，进行PCR扩增，根据聚丙烯酰胺 垂直凝胶电泳结果，选取能扩增出条带、位点条带清晰，且有多态性的引物对，共筛选出38 对SSR标记引物，见表1 ;
[0038] (4)利用步骤⑶筛选出的38对SSR标记引物分别对步骤⑴提取得到的油茶 DNA进行PCR扩增，扩增产物利用8 %聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳检测；
[0039] (5)以电泳检测结果条带的有无进行计数，有记为"1"，无记为"0"，利用 NTYsys2. 0软件计算Dice遗传系数；
[0040] (6)将Dice遗传系数范围分为11个级别范围，分别为0? 370-0. 420、 0? 421-0. 470、0. 471-0.520、0. 521-0.570、0.571-0.620、0.621-0.670、0.671-0.720、 0? 721-0. 770、0. 771-0. 820、0. 821-0. 870、0. 871-0. 920、；在每个 Dice 遗传系数级别内，设 计8个授粉组合，如下表2 ;每个授粉组合采用人工异交授粉处理，每个组合处理200朵花；
[0041](7)对不同的授粉处理，分别在人工授粉处理后的第30天统计结实率：结实率= 果实数/授粉处理花数X 100%;第180天统计坐果率：坐果率=坐果数/结实数X 100%， 结果见表2 ;
[0042] (8)根据步骤（6)设计的组合，以低产油茶为砧木，见表3,采用撕皮嵌芽接进行嫁 接，每个组合均是在300个砧木上嫁接300个穗条；
[0043] (9)嫁接后的第180天统计嫁接成活率，嫁接成活率的计算公式为：嫁接成活率= 穗条成活数/穗条嫁接数，结果见表3。
[0044] 表1 38对SSR标记引物
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[0046]
[0047]
[0048] 表2不同Dice遗传系数组合异交授粉的结实率和坐果率
[0049]
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[0051]
[0052] 表3不同Dice遗传系数砧穗组合间的嫁接成活率
[0053]
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[0056] 由表2知，Dice遗传系数范围0. 521-0. 570的油茶授粉组合为最佳，异交人工授 粉的结实率和坐果率分别达80%和59%以上，极大的提高了油茶的结实率和坐果率。
[0057] 由表3知穗条和砧木间Dice遗传系数在0. 371-0. 720间的砧穗组合的嫁接成活 率较高，达75%以上。
[0058] 综合考虑授粉组合的配合力与嫁接组合的嫁接亲和力，选择Dice遗传系数范围 0. 521-0. 570的油茶为最适的组合。
[0059] 二、检测油茶野生群体的交配系统
[0060] 在玉屏油茶野生居群中，选取5个样方，样方大小均在2亩以上，果实成熟期，每个 样方内随机选取40个单株，每个单株距离在10m以上，收集单株果实。每个样方随机选择 30个单株，对其种子进行混匀，随机选择其中的25粒种子用于DNA提取。
[0061] 利用表1所示38对SSR标记引物，对5个样方内125个DNA样品进行PCR扩增； 扩增产物利用8%聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳检测；以条带有无进行计数，有记为"1"，无记 为 "0"。
[0062] 利用MLTR3. 2软件估算油茶自然栽培和野生居群的单位点异交率（ts)、多样点异 交率（tj和双亲近交系数匕-〇、亲本近交系数（F)和多位点相关度（r pni)，见表4。
[0063] 表4油茶野生居群交配系统
[0064]
[0065]
[0066] 由表4知，油茶野生居群异交率较高，介于0. 927到0. 952之间，说明油茶属专性 异交物种。5个油茶野生居群的多位点异交率都高于单位点异交率，而且位点亲本相关度比 较小，说明居群内近交较少。同时，各群体单位点相关度与多位点相关度差值较小，表明群 体内不存在亚结构。
[0067] 三、确定高异交传粉配置格局
[0068] 在玉屏侗族自治县油茶野生居群内，在油茶盛花期，选取15个样方，对传粉者 访问不同花的飞行距离进行了调查观测。如表4所示：油茶传粉者访问不同花的飞行距 离介于0. 31m到0. 75m之间，平均为0. 583m。因此，在嫁接时，嫁接枝条之间的距离为 0. 31m-〇. 75m〇
[0069] 表4不同株行距油茶传粉者活动规律
[0070]
[0071] 综上所述，本发明通过SSR标记检测油茶种质间的Dice遗传系数，在遗传系数范 围内设计不同的组合，通过观测不同组合的结实率、坐果率和嫁接成活率得到最佳的油茶 组合的Dice遗传系数范围为：0. 521-0. 570 ;其结实率、坐果率和嫁接成活率分别达：80%、 59%和75%以上；再根据油茶访花者的飞行距离，确定油茶在嫁接时，嫁接枝条之间的距 离为0. 31m-0. 75m。本发明提供了一种高嫁接亲和力、高配合力、高异交传粉配置格局的低 产油茶林的丰产高接换冠嫁接模式，实现了油茶产量提高。
[0072] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种油茶丰产高接换冠的分子设计方法，其特征在于，包括以下顺序的步骤： (1) 选择不同油茶种质，分别提取其DNA ; (2) 筛选适用于油茶的SSR标记引物； (3) 利用筛选出的SSR标记引物，计算不同油茶种质DNA间的Dice遗传系数； (4) 将Dice遗传系数划分为11个级别；在每个Dice遗传系数级别内，设计油茶组合； (5) 根据步骤（4)设计的油茶组合，以两个不同油茶种质互为授粉树，进行人工授粉； (6) 根据步骤（4)设计的油茶组合，进行人工嫁接； (7) 在人工授粉后的第30天统计并计算结实率，第180天统计并计算坐果率；得到配 合力最高的Dice遗传系数范围I ; (8) 嫁接后第180天统计并计算嫁接成活率，得到嫁接成活率最高的Dice遗传系数范 围II ; (9) 以步骤（7)、步骤（8)得到的Dice遗传系数范围共同部分的油茶为种质材料，设计 油茶丰产高接换冠模式。2. 如权利要求1所述的一种油茶丰产高接换冠的分子设计方法，其特征在于，所述步 骤⑴提取DNA的方法为改良CTAB法。3. 如权利要求1所述的一种油茶丰产高接换冠的分子设计方法，其特征在于，所述步 骤（6)嫁接方法为撕皮嵌接法。4. 如权利要求1所述的一种油茶丰产高接换冠的分子设计方法，其特征在于，所述步 骤（9)油茶丰产高接换冠模式，油茶的嫁接枝条之间的距离为0.31m-0. 75m，油茶种质之间 的Dice遗传系数范围为0. 521-0. 570。
【专利摘要】本发明公开一种油茶丰产高接换冠的分子设计方法，属于生物技术领域，通过SSR标记检测油茶种质间的Dice遗传系数，再根据结实率和坐果率选配出最佳授粉组合的Dice遗传系数范围Ⅰ；根据嫁接成活率，选出最适嫁接的Dice遗传系数范围Ⅱ，Dice遗传系数范围Ⅰ和Dice遗传系数范围Ⅱ的共同部分为最适油茶组合的Dice遗传系数范围；对此Dice遗传系数范围内的油茶进行高异交传粉设计配置，可有效地降低自交和同株异花授粉发生率，提高异交传粉率，从而保证油茶高产。
【IPC分类】A01H1/02, C12Q1/68, A01H1/04, A01G1/06
【公开号】CN105052566
【申请号】CN201510507948
【发明人】阮成江
【申请人】大连民族大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月18日