一种三倍体矮牵牛的培育方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于园艺植物遗传育种领域，特别涉及一种三倍体矮牵牛的培育方法。
【背景技术】
[0002] 矮牵牛（Petunia hybrida Vilm.)为前科碧冬前属植物，为一年生草本花丼。矮 牵牛花朵硕大，色彩丰富，花型变化颇多，目前矮牵牛在国际上已成为主要的盆花和装饰植 物，广泛应用于庭院、露天花坛、广场的美化装饰与绿化，被喻为"世界花坛花卉之王"。我国 矮牵牛于20世纪初开始少量引种栽培，80年代逐渐从欧美等国引进新品种进行规模种植， 现在随着经济发展和城市建设需要对矮牵牛需求越来越大，目前国内广泛种植的优良矮牵 牛品种如重瓣"双瀑布"系列、大花"梦幻"系列、多花单瓣"庆典"系列和吊蓝等系列都为国 外培育的二倍体品种。
[0003] 通过倍性育种可使植物基因组多倍化获得生长势旺盛、适应性强、抗逆性好的品 种，应用于观赏植物可提高花卉的观赏性与品质。三倍体是指体细胞中含有三个染色体 组，不但具有多倍体的优良特性而且可以利用杂种优势、获得无籽果实，并且作为遗传育种 桥梁材料选育出的系列单体和三体可应用于染色体上基因定位、确定基因连锁群等遗传研 究。培育三倍体一般先诱导形成遗传稳定的四倍体，再由四倍体和二倍体杂交获得三倍体， 此法育种周期较长。迄今为止，还没有三倍体矮牵牛（2n = 3x = 21)培育方法的公开报道。
【发明内容】
[0004] 发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种三倍体矮牵牛的培育方法。此种 方法育种周期短、操作简便诱变效率高。
[0005] 技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种三倍体矮牵牛的培育方法， 该方法包括如下步骤：
[0006] 1)选择杂交优势较强的二倍体组合作为亲本，按常规技术种植；
[0007] 2)在亲本进入花期时，用化学诱导剂诱导父本植株上的花蕾，使之产生2n花粉；
[0008] 3)诱导后花蕾纵轴长度生长至1. 5cm~2. 6cm时，采摘放置于低温、干燥、黑暗处 保存；
[0009] 4)杂交前对母本进行去雄处理，将步骤3)中诱导花蕾中的2n花粉取出，涂于母本 去雄花蕾的柱头上，植株结实后得到F1杂交种子；同时将父本没有经过诱导处理的n花粉 涂于母本去雄花蕾的柱头上，植株结实后得到对照二倍体 Fl杂交种子；
[0010] 5)将Fi杂交种子生长至成植，筛选出三倍体植株。
[0011] 其中，上述的化学诱导剂为秋水仙素、氨磺灵和氟乐灵的混合药液。秋水仙素的最 终质量浓度为0. 1%~0. 5%，氨磺灵最终质量浓度为20mg. L 1~50mg. L \氟乐灵最终质 量浓度为50mg. L 1~100mg. L、
[0012] 其中，上述步骤2)诱导的方法为：上午8~10时温室大棚内温度控制在22~ 33°C，选择父本植株上纵轴长度为2. 2mm~3. 4mm花蕾，用微量注射器将化学诱导剂混合药 液注入花蕾内，每次10~15yL，连续1~3天。
[0013] 步骤3)具体方法为：采摘经诱导处理纵轴长度生长至1. 5cm~2. 6cm的花蕾，放 置于密闭的容器中（内含无水氯化钙或无水硫酸镁或硅胶等干燥剂），并用黑色遮光物覆 盖，将容器放置于冷柜中温度设置为3~10°C，可存放1~3天，等待授粉的合适时机。
[0014] 步骤4)中，杂交前对母本进行去雄处理，是指杂交前选择母本植株上纵轴长度达 2. 5厘米或以上的未开花花蕾，对花蕾进行去除雄蕊后套袋隔离，1~3天后进行杂交授粉； 父本没有经过经过诱导处理的n花粉，是指选择父本植株上没有经化学药剂处理、纵轴长 度达2. 5厘米或以上的未开花花蕾，进行套袋隔离，1~2天后取花粉进行授粉。
[0015] 其中，上述步骤5)的筛选方法为：将匕杂交种、对照二倍体Fi杂交种按常规技术 种植，成株后先进行农艺性状、解剖学比较，选择多倍体特征明显的植株，再进行细胞学染 色体检测确定三倍体植株。
[0016] 其中，上述步骤1)中杂交优势较强的二倍体组合是指匕杂交后代的株高、冠幅、 茎粗、叶面积、开花数的农艺性状超过双亲。
[0017] 其中，上述步骤3)中，低温、干燥黑暗处是指3~10°C、干燥剂干燥和遮光。
[0018] 其中，上述步骤5)中农艺性状为：叶片长度与宽度、叶面是否扭曲、茎粗、株高、冠 幅、萼片长度与宽度、柱头和花药大小、花瓣直径、花瓣边缘褶皱程度。
[0019] 步骤5)农艺性状鉴定指，在Fi杂交群体中选择第5~10片真叶平均长度与宽 度、主茎粗、株高、冠幅、萼片长度与宽度、柱头直径、花药长度与宽度、花瓣直径其中有任意 5项或5项以上数值显著大于对照二倍体匕杂交种，同时叶面扭曲、花瓣边缘波状褶皱程度 明显大于对照二倍体匕杂交种的植株。
[0020] 其中，上述步骤5)中解剖学观察性状有气孔和花粉细胞，观察气孔方法为：将叶 片背面表皮撕下，在显微镜下测量表皮气孔大小；观察花粉细胞方法为：对成熟花粉进行 染色，在显微镜镜下测量成熟花粉细胞大小。解剖学中气孔鉴定指，用尖头镊子将叶片背面 表皮撕下，放置于载玻片上，滴1~2滴清水在20或40倍显微镜下用具有显微测微标尺的 目镜测量气孔长与宽度，选择长、宽度显著大于对照二倍体匕杂交种的植株。
[0021] 花粉细胞鉴定指：从开放花朵中取少量成熟花粉，放置于载玻片上，滴1~2滴质 量浓度为1%醋酸洋红染色3~5分钟，在20或40倍显微镜下用具有显微测微标尺的目镜 测量花粉细胞大小，选择花粉平均直径、不育花粉率（形状畸形和不染色）明显大于对照二 倍体？ 1杂交种的植株。
[0022] 其中，上述步骤5)中细胞学染色体检测方法为：
[0023] 晴天上午8~10时取长度3. 1~7. 3謹的幼蕾，立即放入装有0? 002mol. L V羟 基喹啉水溶液0~10°C容器中，放置在0~10°C的冷柜中预处理1~5小时，蒸馏水冲洗 3~5次后转入卡诺氏固定液固定12~24小时，蒸馏水冲洗3~5次，lmol. L iCl溶液 50~60°C水浴解离3~6分钟，蒸馏水冲洗3~5次用滤纸吸干水，放入体积百分浓度为 45%的醋酸溶液配制的质量浓度1 %的洋红染色液染色12~24小时，用镊子将幼蕾移入干 净的载玻片上，用刀片切取雌蕊子房，用镊子取子房中心部位少量分生组织，放置于载玻片 上，滴1~2滴1%洋红染色液，盖上盖玻片，先在低倍镜下寻找有丝分裂中期分裂相视野， 然后在100倍油镜下进行染色体计数，选择体细胞染色体数目2n = 3x = 21的三倍体植株。
[0024] 其中，上述卡诺氏固定液是由无水乙醇和冰醋酸按体积比3:1制成的。
[0025] 其中，上述体积百分浓度45%醋酸溶液配制的质量浓度1%的洋红染色液配制方 法为：先加入45ml乙酸再加水55ml，混匀后将洋红粉末1克缓慢倒入100ml 45 %醋酸溶液 中，边煮边搅拌，煮沸冷却后过滤即可使用。
[0026] 有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0027]1、现有技术大多先诱导形成四倍体再与二倍体杂交形成三倍体，本发明所述方法 通过直接诱导矮牵牛二倍体形成2n花粉再与二倍体杂交形成三倍体，显著缩短育种时间， 操作简便易行；对2n花粉进行低温保存延长了花粉活力，解决花期不遇，方法简单易行。
[0028] 2、诱导剂的选择：本发明采用秋水仙素、氨磺灵和氟乐灵混合液为诱导剂，通过干 扰纺锤丝形成从而抑制细胞有丝分裂使染色体加倍，三者混合使用后可提高2n花粉诱导 率。
【附图说明】
[0029] 图1在100倍油镜下观察三倍体植株子房分生组织体细胞的染色体数目，2n= 21 ；
【具体实施方式】
[0030] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
[0031] 实施例1 一种三倍体矮牵牛的培育方法
[0032] 1)选择二倍体矮牵牛Petuniahybrida'Pink'为父本，二倍体矮牵牛Petunia hybrida'RoseHalo'为母本，均购于浙江虹越花丼股份有限公司，按常规技术种植；
[0033] 2)父母本进入花期，于上午9时温室大棚内温度28°C，选择父本植株上长度为 2. 6mm~3. 1mm花蕾，用微量注射器将去离子水配制最终质量浓度秋水仙素0. 2%，氨磺灵 30mg. L 1，氟乐灵80mg. L 1，体积为10 y L混合药液注入花蕾内，处理1次；花粉成熟后，取花 粉粒于载玻片上用质量浓度为1 %醋酸洋红染色，在40倍镜下用显微测微尺测量花粉的直 径并结合外观特征确认2n花粉，经统计2n花粉率可达40. 1 %。
[0034] 3)诱导处理后花蕾纵轴长度生长至1. 8cm~2. 2cm时，采摘放置于密闭的玻璃干 燥器中（内含硅胶