灵最终质量浓度为 50mg. L\氟乐灵最终质量浓度为100mg. L1的混合药液注入花蕾内，每次15 y L，连续3天；
[0067] 花粉成熟后，取花粉粒于载玻片上用质量浓度为1 %醋酸洋红染色，在40倍镜下 用显微测微尺测量花粉的直径并结合外观特征确认2n花粉，经统计2n花粉率可达38. 8 %。
[0068] 3)诱导后花蕾纵轴长度生长至1. 5cm~2. 6cm时，放置于密闭的容器中（内含无 水氯化钙或无水硫酸镁或硅胶等干燥剂），并用黑色遮光物覆盖，将容器放置于冷柜中温度 设置为3~1(TC，可存放1~3天，等待授粉的合适时机；
[0069] 4)杂交前对母本进行去雄处理，选择母本植株上纵轴长度3. 3~3. 8厘米的未开 花花蕾，对花蕾进行去除雄蕊后套袋隔离，第2天进行杂交授粉；
[0070] 5)选择父本植株上纵轴长度2. 7~3. 8厘米的未开花花蕾进行套袋隔离，1~2 天后取花粉进行授粉。
[0071] 6)杂交前对母本进行去雄处理，将步骤3)中诱导花蕾中的2n花粉取出，涂于母本 去雄花蕾的柱头上，植株结实后得到F1杂交种子；同时将父本没有经过诱导处理的n花粉 涂于母本去雄花蕾的柱头上，植株结实后得到对照二倍体 Fl杂交种子；
[0072] 7)将Fi杂交种、对照二倍体F1杂交种按常规技术种植，成株后先进行农艺性状、 解剖学比较，选择多倍体特征明显的植株，再进行细胞学染色体检测确定三倍体植株。
[0073] 上述农艺性状为：叶片长度与宽度、叶面是否扭曲、茎粗、株高、冠幅、萼片长度与 宽度、柱头和花药大小、花瓣直径、花瓣边缘褶皱程度。
[0074]农艺性状鉴定指，在匕杂交群体中选择第5~10片真叶平均长度与宽度、主茎粗、 株高、冠幅、萼片长度与宽度、柱头直径、花药长度与宽度、花瓣直径其中有任意5项或5项 以上数值显著大于对照二倍体匕杂交种，同时叶面扭曲、花瓣边缘波状褶皱程度明显大于 对照二倍体？ :杂交种的植株。
[0075]解剖学观察性状有气孔和花粉细胞，观察气孔方法为：将叶片背面表皮撕下，在显 微镜下测量表皮气孔大小；观察花粉细胞方法为：对成熟花粉进行染色，在显微镜镜下测 量成熟花粉细胞大小。解剖学中气孔鉴定指，用尖头镊子将叶片背面表皮撕下，放置于载玻 片上，滴1~2滴清水在20或40倍显微镜下用具有显微测微标尺的目镜测量气孔长与宽 度，选择长、宽度显著大于对照二倍体匕杂交种的植株。
[0076] 花粉细胞鉴定指：从开放花朵中取少量成熟花粉，放置于载玻片上，滴1~2滴质 量浓度为1 %醋酸洋红染色3~5分钟，在20或40倍显微镜下用具有显微测微标尺的目镜 测量花粉细胞大小，选择花粉平均直径、不育花粉率（形状畸形和不染色）明显大于对照二 倍体？ 1杂交种的植株。
[0077] 细胞学染色体检测方法为：
[0078] 晴天上午8~10时取长度3. 1~7. 3謹的幼蕾，立即放入装有0? 002mol. L V羟 基喹啉水溶液0~10°C容器中，放置在0~10°C的冷柜中预处理1~5小时，蒸馏水冲洗 3~5次后转入卡诺氏固定液固定12~24小时，蒸馏水冲洗3~5次，lmol. L iCl溶液 50~60°C水浴解离3~6分钟，蒸馏水冲洗3~5次用滤纸吸干水，放入体积百分浓度为 45%的醋酸溶液配制的质量浓度1 %的洋红染色液染色12~24小时，用镊子将幼蕾移入干 净的载玻片上，用刀片切取雌蕊子房，用镊子取子房中心部位少量分生组织，放置于载玻片 上，滴1~2滴1%洋红染色液，盖上盖玻片，先在低倍镜下寻找有丝分裂中期分裂相视野， 然后在100倍油镜下进行染色体计数，选择体细胞染色体数目2n = 3x = 21的三倍体植株。
[0079] 卡诺氏固定液是由无水乙醇和冰醋酸按体积比3:1制成的。
[0080] 体积百分浓度45%醋酸溶液配制的质量浓度1%的洋红染色液配制方法为：先加 入45ml乙酸再加水55ml，混匀后将洋红粉末1克缓慢倒入100ml45%醋酸溶液中，边煮边 搅拌，煮沸冷却后过滤即可使用。
[0081] 实施例4
[0082] 基本步骤与实施例1一样，所不同的在于本实施例是具体的对64个不同诱导处理 中以秋水仙素浓度〇.1~〇.5%，氨磺灵浓度20~50mg. L\氟乐灵浓度50~100mg. L1的 混合药剂诱导效果最好，2n花粉率高于其它处理和对照。
[0083] 表1不同药剂配方诱导2n花粉效果的比较
[0084]
[0085]
【主权项】
1. 一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，该方法包括如下步骤： 1) 选择杂交优势较强的二倍体组合作为亲本，按常规技术种植； 2) 在亲本进入花期时，用化学诱导剂诱导父本植株上的花蕾，使之产生2n花粉； 3) 诱导后花蕾纵轴长度生长至I. 5cm~2. 6cm时，采摘放置于低温、干燥、黑暗处保存； 4) 杂交前对母本进行去雄处理，将步骤3)中诱导花蕾中的2n花粉取出，涂于母本去 雄花蕾的柱头上，植株结实后得到Fl杂交种子；同时将父本没有经过诱导处理的n花粉涂 于母本去雄花蕾的柱头上，植株结实后得到对照二倍体F 1杂交种子； 5) 将F1杂交种子生长至成植，筛选出三倍体植株。2. 根据权利要求1所述的一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，所述的化学诱 导剂为秋水仙素、氨磺灵和氟乐灵的混合药液，其中秋水仙素的最终质量浓度为〇. 1%~ 0.5%，氨磺灵最终质量浓度为20 mg. L1~50 mg. L \氟乐灵最终质量浓度为50 mg. L1~ 100 mg. L 1O3. 根据权利要求1所述的一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，所述步骤2)诱 导的方法为：选择父本植株上纵轴长度为2. 2mm~3. 4_花蕾，用微量注射器将化学诱导剂 混合药液注入花蕾内，每次10~15 y L，连续1~3天。4. 根据权利要求1所述的一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，所述步骤5)的 筛选方法为：将F1杂交种、对照二倍体F :杂交种按常规技术种植，成株后先进行农艺性状、 解剖学比较，选择多倍体特征明显的植株，再进行细胞学染色体检测确定三倍体植株。5. 根据权利要求1所述的一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，所述步骤1)中 杂交优势较强的二倍体组合是指匕杂交后代的株高、冠幅、茎粗、叶面积、开花数的农艺性 状超过双亲。6. 根据权利要求4所述的一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，所述步骤5)中 农艺性状为：叶片长度与宽度、叶面是否扭曲、茎粗、株高、冠幅、萼片长度与宽度、柱头和花 药大小、花瓣直径、花瓣边缘褶皱程度。7. 根据权利要求4所述的一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，所述步骤5)中 解剖学观察性状有气孔和花粉细胞，观察气孔方法为：将叶片背面表皮撕下，在显微镜下测 量表皮气孔大小；观察花粉细胞方法为：对成熟花粉进行染色，在显微镜镜下测量成熟花 粉细胞大小。8. 根据权利要求4所述的一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，所述步骤5)中 细胞学染色体检测方法为： 取长度3. 1~7. 3mm的幼蕾，0? 002mol. L 羟基喹啉水溶液0~10°C预处理1~5小时， 蒸馏水冲洗3~5次后转入卡诺氏固定液固定12~24小时，蒸馏水冲洗3~5次，lmol. L-IHCl 溶液50~60°C水浴解离3~6分钟，蒸馏水冲洗3~5次用滤纸吸干水，放入体积百分浓度45% 醋酸溶液配制的质量浓度1%的洋红染色液染色12~24小时，用镊子将幼蕾移入干净的载玻 片上，用刀片切取雌蕊子房，用镊子取子房中心部位少量分生组织，放置于载玻片上，滴1~2 滴1%洋红染色液，压片观察统计体细胞染色体数目，筛选2n=3x=21的三倍体植株。9. 根据权利要求8所述的一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，所述卡诺氏固 定液是由无水乙醇和冰醋酸按体积比3:1制成的。10. 根据权利要求8所述的一种三倍体矮牵牛的培育方法，其特征在于，所述体积百分
【专利摘要】本发明公开了一种三倍体矮牵牛的培育方法，包括以下步骤：选择杂种优势强的二倍体矮牵牛组合作为杂交亲本，在父本开花期选择适当大小的花蕾，用秋水仙素、氨磺灵和氟乐灵混合药液进行化学诱变促使形成2n花粉，将2n花粉授粉到二倍体母本柱头上得到F1杂交种子，同时将父本没有经化学诱变处理的n花粉与母本杂交得到对照二倍体F1杂交种子。F1杂交种子发育的成株与对照二倍体F1杂交后代进行农艺性状、解剖学比较，在此基础上再进行染色体数目检测，最终确定三倍体植株。本发明育种周期短、操作简便诱变效率高，具有较好的应用前景。
【IPC分类】A01H1/08, A01H1/02
【公开号】CN105052730
【申请号】CN201510605407
【发明人】魏跃, 樊开青, 陈啸寅, 颜志明, 王全智, 贾思振, 史红林
【申请人】江苏农林职业技术学院
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月21日