一种适用于提取禾本科植物基因组dna的新鲜叶片保存液及其保存方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适用于提取禾本科植物基因组DNA的新 鲜叶片保存液及其保存方法和应用。
【背景技术】
[0002] 用于分子生物学研究的植物材料大部分是从远离实验室的野外采集获得的，从野 外到实验室，植物材料的保存是一个关键的环节。在提取植物叶片DNA的研究中，常规方法 多采用新鲜或冷冻的材料，但这些常规方法对野外采集样品显然不适用。特别是在交通十 分不便的地区，对大量采集样品进行系统学研究造成极大的不便，同时植物叶片中富含酚 类、糖类及其他的次生代谢产物，这些物质很容易使新鲜的植物叶片发生褐变，采集的叶片 如不采用适当的处理方法，叶片褐化很快，从而严重影响植物基因组DNA的提取质量。有研 究表明，用硅胶干燥保存的野外标本的叶子可用于基因组DNA的提取。但研究发现，从硅胶 脱水干燥的样品中提取的DNA有不同程度的降解，其质量不如从鲜样中提取的。
[0003] 植物表皮位于表皮细胞的外面，有沉积的角质层和蜡质组成。角质层实质为网状 结构，在形成过程中蜡质填充其间，这些填充在角质层网状结构内的腊层被称为内蜡质层； 在角质层外又形成只有蜡质成分的结构，为外蜡质层，外蜡质层一般会形成自我组装的蜡 质晶体。植物表皮蜡质一般由脂溶性的脂肪酸、烷烃、脂肪醇、醛类、酮类和酯类组成。在分 子生物学的研究中，植物表皮蜡质通常不能有效地去除，会影响到后续所提取的植物叶片 DNA的纯度和质量。
[0004]因此，探索新鲜植物材料的常温保存方法对后续分子生物学研究具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种适用于提取禾本科植物基因组DNA的新 鲜叶片保存液及其保存方法和应用。本发明提供的适用于提取禾本科植物基因组DNA的新 鲜叶片保存液能用于常温、长期保存禾本科植物叶片。
[0006] 第一方面，本发明提供了一种适用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片保存 液，包括：
[0007]
[0008] 余量为水。
[0009] 优选地，所述禾本科植物为狗牙根、结缕草或水稻。
[0010] 第二方面，本发明提供了一种禾本科植物新鲜叶片的保存及基因组DNA的提取方 法，包括如下步骤：
[0011] (1)配制含有如下成分的保存液：
[0012]
[0013] 余量为水；
[0014] 按照所述保存液中各成分的比例将十二烷基硫酸钠（SDS)、乙醇、氯仿、NaAc、 EDTA、NaCl用超纯水溶解和混合后，调节pH= 8.0,定容，然后置于灭菌瓶中在121°C、 0·IMpa灭菌 20min;
[0015] (2)灭菌后，加入2%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP)，得到混合液，备用；
[0016] (3)将禾本科植物新鲜叶片剪切为截面不大于0. 5cm2的条块；
[0017] (4)使用前，向（2)中的混合液中加入β-巯基乙醇至终浓度为2%，制得保存液；
[0018] (5)将所述禾本科植物新鲜叶片条块浸没在（4)中的保存液中，常温保存；
[0019] (6)取步骤（5)保存有禾本科植物新鲜叶片条块的保存液在65°C下加热3-5min， 再采用常规SDS法提取基因组DNA。
[0020] 优选地，所述禾本科植物为狗牙根、结缕草或水稻。
[0021] 第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的适用于提取禾本科植物基因组 DNA的新鲜叶片保存液或第二方面所述的用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片常温 保存的方法在禾本植物保存中的应用。
[0022] 第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的适用于提取禾本科植物基因组 DNA的新鲜叶片保存液或如第二方面所述的用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片常 温保存的方法在提取禾本科植物基因组DNA的应用。
[0023] 本发明的有益效果在于：
[0024] (1)本发明提供的保存液及其保存方法简单有效、成本低廉；
[0025] (2)本发明提供的保存液不含CTAB，对人体无害，适用于禾本科植物新鲜叶片的 常温保存，有效期长；
[0026] (3)本发明提供的保存液用于保存禾本科植物新鲜叶片，保存液所含的氯仿成分 可以有效溶解植物表皮的蜡质成分，破坏植物表皮结构，有利于保存液快速渗透细胞，还有 利于后续DNA提取过程中去除植物表皮蜡质成分，提高DNA纯度；
[0027] (4)本发明提供的保存液用于提取禾本科植物基因组DNA，所含多糖、多酚、蛋白 质少，能获得研究所需要的高质量的DNA。
【附图说明】
[0028] 图1是本发明实施例提供的SDS法提取狗牙根叶片基因组DNA琼脂糖凝胶电泳 图；
[0029] 图2是本发明实施例提供的狗牙根叶片基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图和聚丙烯酰 氨凝胶电泳检测狗牙根叶片SSR引物（SC49)PCR扩增产物图；
[0030]图3是本发明实施例提供的SDS法提取结缕草叶片基因组DNA琼脂糖凝胶电泳 图；
[0031] 图4是本发明实施例提供的SDS法提取水稻叶片基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；
[0032]图5是本发明实施例提供的SDS法提取柱花草叶片基因组DNA琼脂糖凝胶电泳 图。
【具体实施方式】
[0033] 下面将结合附图和实施例进行详细的描述。
[0034] 实施例1
[0035] 本发明实施例提供了一种用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片常温保存 的方法，包括：
[0036] (1)配制含有如下成分的保存液：
[0037]
[0038] 余量为水；
[0039] 按照所述保存液中各成分的比例将SDS(十二烷基硫酸钠）、乙醇、氯仿、EDTA、 NaCl用超纯水溶解和混合后，调节pH= 8.0,定容，然后置于灭菌瓶中在121°C、0.IMpa灭 菌 20min;
[0040] (2)灭菌后，加入2%的PVP，得到混合液，备用；
[0041] (3)将新鲜狗牙根叶片切割为截面不大于0. 5cm2的条块；
[0042] (4)使用前，向（2)中的混合液中加入β-巯基乙醇至终浓度为2%，制得保存液；
[0043] (5)将所述新鲜狗牙根叶片条块浸没在（4)中的保存液中，常温保存30天。
[0044] 实施例2
[0045] 本发明实施例提供了一种用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片常温保存 的方法，包括：
[0046] (1)配制含有如下成分的保存液：
[0049]余量为水；
[0050] 按照所述保存液中各成分的比例将SDS(十二烷基硫酸钠）、乙醇、NaAc、EDTA、 NaCl用超纯水溶解和混合后，调节pH= 8.0,定容，然后置于灭菌瓶中在121°C、0.IMpa灭 菌 20min;
[0051] (2)灭菌后，加入2%的PVP，得到混合液，备用；
[0052] (3)将新鲜狗牙根叶片剪切为截面不大于0.5cm2的条块；
[0053] (4)使用前，向⑵中的混合液中加入β-巯基乙醇至终浓度为2%，制得保存液；
[0054] (5)将所述新鲜狗牙根叶片条块浸没在（4)中的保存液中，常温保存30天。
[0055] 实施例3
[0056] 本发明实施例提供了一种用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片常温保存 的方法，包括：
[0057] (1)配制含有如下成分的保存液：
[0058]
[0059] 余量为水；
[0060] 按照所述保存液中各成分的比例将SDS(十二烷基硫酸钠）、乙醇、氯仿、NaAc、 EDTA、NaCl用超纯水溶解和混合后，调节pH= 8.0,定容，然后置于灭菌瓶中在121°C、 0·IMpa灭菌 20min;
[0061] (2)灭菌后，加入2%的PVP，得到混合液，备用；
[0062] (3)将新鲜狗牙根叶片切割为截面不大于0. 5cm2的条块；
[0063] (4)使用前，向⑵中的混合液中加入β-巯基乙醇至终浓度为2%，制得保存液；
[0064] (5)将所述新鲜狗牙根叶片条块浸没在（4)中的保存液中，常温保存30天。
[0065] 实施例4
[0066] 本发明实施例提供了一种用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片常温保存 的方法，包括：
[0067] (1)配制含有如下成分的保存液：
[0068]
[0069] 余量为水；
[0070] 按照所述保存液中各成分的比例将SDS(十二烷基硫酸钠）、乙醇、氯仿、NaAc、 EDTA、NaCl用超纯水溶解和混合后，调节pH= 8.0,定容，然后置于灭菌瓶中在121°C、 0·IMpa灭菌 20min;
[0071] (2)灭菌后，加入2%的PVP，得到混合液，备用；
[0072] (3)将新鲜狗牙根叶片切割为截面不大于0. 5cm2的条块；
[0073] (4)使用前，向（2)中的混合液中加入β-巯基乙醇至终浓度为2%，制得保存液；
[0074] (5)将所述新鲜狗牙根叶片条块浸没在（4)中的保存液中，常温保存30天。
[0075] 实施例5
[0076] 本发明实施例提供了一种用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片常温保存 的方法，包括：
[0077] (1)配制含有如下成分的保存液：
[0080]余量为水；
[0081] 按照所述保存液中各成分的比例将SDS(十二烷基硫酸钠）、乙醇、氯仿、NaAc、 EDTA、NaCl用超纯水溶解和混合后，调节pH= 8.0,定容，然后置于灭菌瓶中在121°C、 0·IMpa灭菌 20min;
[0082] (2)灭菌后，加入2%的PVP，得到混合液，备用；
[0083] (3)将新鲜狗牙根叶片切割为截面不大于0.5cm2的条块；
[0084] (4)使用前，向⑵中的混合液中加入β-巯基乙醇至终浓度为2%，制得保存液；
[0085] (5)将所述新鲜狗牙根叶片条块浸没在（4)中的保存液中，常温保存30天。
[0086] 实施例6
[0087] 采用SDS法对经过实施例1-3所提供的保存液保存30天后的狗牙根叶片、经过冰 箱冷冻保存30天后的狗牙根叶片、以及新鲜的狗牙根叶片（嫩叶）进行DNA提取，包括如 下步骤：
[0088] (1)经过实施例1和3所提供的保存液保存30天后的狗牙根叶片实验组：常温保 存30天后，将实施例1和3提供的保存有新鲜狗牙根叶片条块的保存液在65°C下加热30s， 然后移入2ml离心管中（分别按次序标记为1、3)，实施例2提供的保存液保存30天后的狗 牙根叶片则不做热处理，编号为2。