[0089] (2)经过冰箱冷冻保存30天后的狗牙根叶片对照组：在_80°C条件下，冷冻保存 30天后，称取狗牙根叶片0. 2g放入液氮预冷过的研钵中，加入液氮至浆状，移入2ml离心管 中（标记为4)。
[0090] (3)新鲜狗牙根叶片对照组：称取新鲜的狗牙根叶片0.2g放入液氮预冷过的研钵 中，加入液氮至浆状，移入2ml离心管中（标记为5)。
[0091] (4)分别往1-5号离心管中加入65°C预热的800μ1的SDS提取液，振荡混匀后， 在 65°C水浴 30min。
[0092] (5) 65°C水浴30min后，加入200μ1 5M的醋酸钠溶液，混匀后水浴20-30min，不时 震动以免成团。
[0093] (6)加入体积比为24:1的氯仿-异戊醇800μ1，充分混匀，在室温下，10000r/min 离心5min〇
[0094] (7)将上清液转移至另一 2ml的离心管中，加入_20°C预冷的0· 6-1. 0倍体积的异 丙醇，缓慢混匀，使DNA呈线团状沉淀析出。
[0095] (8) 1000(^/1^11离心31^11，弃去上清液，加入70%的乙醇洗涤，吹干。
[0096] (9)加入适量TE缓冲液（10mmol/LTris-HCl，lmmol/LEDTA，pH= 8. 0)溶解，加 入1/10体积的RNaSeA(10mg/ml)，37°C条件下恒温lh，出去RNA;并置于-20°c冰箱中保存 备用。
[0097] (10)采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计法检测（6)中狗牙根叶片所提取的 DNA的纯度。
[0098] (11)采用狗牙根SSR引物SC49对步骤（9)中狗牙根叶片基因组DNA的可靠 性进行PCR验证，SSR引物SC49序列为上游：5' -CAAGGACCACATCACCATCA-3'，下游： 5' -CGGCCATTGATTATCTGTGA-3'。
[0099]PCR扩增体系为（20μ1) :Mg2+(l.Ommol.LMgCU1. 5μ1，10XPCRBuffer2μ1， 0· 2mmol·LMNTPs0· 3μ1，Taq酶（5U·μ1 30. 2μ1，0· 4ymmol·L1引物 3μ1，模板 DNA3yl，ddH20 10μ1。PCR反应程序为：95°C预变性 5min，94°C变性 30s，55°C退火 30s， 72°C延伸40s，循环36次，72°C延伸7min，4°C保存。
[0100] 实验结果
[0101] (1)采用紫外分光光度计法检测狗牙根叶片基因组DNA的纯度，基因组DNA的 A260/A280和A260/A230的比值，并对其进行比较，结果如表1所示，其中，1、2、3、4、5分别 为来自五种不同的狗牙根叶片所提取的基因组DNA(1 :实施例1所提供的保存液保存的狗 牙根叶片；2 :实施例2所提供的保存液保存的狗牙根叶片；3 :实施例3所提供的保存液保 存的狗牙根叶片；4 :冰箱冷冻保存的狗牙根叶片；5 :新鲜狗牙根叶片）。从表1中可知，五 种叶片所提取的基因组DNA的A260/A280都接近1. 8 ;经过实施例1-3 (表1组1、3)、冰箱 冷冻保存的叶片（表1组4)和新鲜叶片（表1组5)提供的保存液保存的叶片所提取的基 因组DNA的A260/A230都接近2. 0,说明这些方法保存的叶片的基因组DNA纯度较高；而经 过实施例1提供的保存液保存的叶片的A260/A230小于2 (表1组2)，说明实施例2提供的 无氯仿保存液保存的狗牙根叶片所提取的DNA比值浓度偏低。
[0102] 表1SDS法提取狗牙根叶片基因组DNA紫外分光光度计检测结果
[0103]
[0104](2)各组琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示（M为DNAMarker，TakaraDL2000bp)，其 中，1、2、3、4、5分别为来自五种不同的狗牙根叶片所提取的基因组DNA(1 :实施例1所提供 的保存液保存的狗牙根叶片；2 :实施例2所提供的保存液保存的狗牙根叶片；3 :实施例3 所提供的保存液保存的狗牙根叶片；4 :冰箱冷冻保存的狗牙根叶片；5 :新鲜狗牙根叶片）。
[0105]由图1可知，相比实施例3(泳道3)，经过实施例1和2提供的保存液保存的狗牙 根叶片所提取的DNA条带（即泳道1和2)较为模糊，有较多降解，其中实施例1保存液中 没有乙醇成分的DNA条带降解最明显。
[0106]而相比保存液中添加了氯仿成分的实施例1和3 (泳道1和3)，保存液中没有添加 了氯仿成分的实施例2、以及新鲜采集的叶片、经冰箱-80°C保存的叶片的DNA点样孔处的 亮点较为明显（泳道2、4和5)，DNA可能含有蛋白或糖类杂质；说明叶片保存时氯仿的存在 可以提高DNA纯度，降低蛋白或糖类等杂质。
[0107] (3)此外，本发明还采用实施例3的保存液，按照实施例3及6(1)-(9)的步骤，对 不同狗牙根种质叶片进行保存、以及DNA提取，并采用琼脂糖凝胶电泳检测叶片所提取的 DNA的纯度，采用聚丙烯酰氨凝胶电泳检测不同狗牙根种质SSR引物（SC49)PCR扩增产物 图。
[0108] 实验结果如图2所示（图2中，A和B中泳道1-12分别对应编号为1-12的不同 叶片材料。）图2-A为狗牙根叶片基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图，其中，1-12分别为不同 种质的狗牙根叶片所提取的基因组DNA。图2-B是聚丙烯酰氨凝胶电泳检测12份不同种质 的狗牙根SSR引物（SC49)PCR扩增产物图。由图2可知，经过实施例3提供的保存液保存 的狗牙根叶片所提取的DNA能用于SSR引物扩增检测。
[0109] 实施例7
[0110] 为了进一步说明本发明的技术效果，本发明还采用实施例3的保存液，按照实施 例6 (1) - (9)的步骤，对结缕草和水稻进行保存、以及DNA提取，并采用琼脂糖凝胶电泳检测 结缕草叶片和水稻叶片所提取的DNA的纯度。
[0111] 实验结果
[0112] (1)对结缕草叶片所提取的DNA采用1. 0%的琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外下成像 结果如图3所示，其中，1、2、3分别为不同结缕草种质叶片所提取的基因组DNA。
[0113] (2)对水稻叶片所提取的DNA采用1. 0 %的琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外下成像结 果如图4所示，其中，1、2、3分别为不同水稻种质叶片所提取的基因组DNA。
[0114] 由图3和图4可知，经过实施例3提供的保存液保存的结缕草叶片和水稻叶片所 提取的DNA条带（参见泳道5)较为清晰，基本无降解，纯度较高。
[0115] 实施例8
[0116] 为了进一步说明本发明的技术效果，本发明还采用实施例3的保存液，按照实施 例6的步骤对柱花草叶片进行保存、以及DNA提取、分析。
[0117] 琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示，泳道1-4为不同柱花草种质样品。由图5可知， 保存30天后的柱花草叶片DNA有明显降解，所提取的DNA浓度较低；所提取的DNA的蛋白 含量、糖、多酚类杂质含量偏高。说明对于多酚、多糖含量高的植物，需进一步摸索保存液的 配方、保存时间及保存条件，改进配方以期。
[0118] 本发明的适用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片保存液及其保存方法用 于禾本科植物样品保存，不限于本发明实施例中的狗牙根、结缕草、水稻叶片。
[0119] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种适用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片保存液，其特征在于，所述保存 液包括： 十二燒基硫酸纳，按质量/体积比： 1,4%,即l,4g/100mL; 乙醇，按体积/体积比： 5-10%; 氯仿，按体积/体积比: 5-10%; β-硫基乙醇，按体积/体积比: 2%; 错酸钠，pH=4,S_: 100ramo4/L; 乙二胺四乙锻： 50mmol/L; 氣化/纳： 500mmoi/L.: 聚乙烯吡咯烷酮按质量,/体积:比:: 2%,即2g/100mL; 余量为水。2. -种如权利要求1所述的适用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片保存液，其 特征在于，所述禾本科植物为狗牙根、结缕草或水稻。3. -种禾本科植物新鲜叶片的保存及基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括如下 步骤： (1) 配制含有如下成分的保存液： 十二烷基硫酸钠，按质量/体积比： 1,4%,即1.4g/100mL; 6醇，按体积八本枳比： 5-10%; 氯仿，按体积八本积比： 5-10%; β-?是基乙醇，按体枳/体积比： 2%; 错酸納，ρΗ==4.8: 100nimol/L.; .乙二.胺四乙酸： 50mmol/L: 氯化钠： 500mmol/L; 聚乙烯吡咯烷酮，按质量以本积比： 2%,即2g/100mL; 余量为水； 按照所述保存液中各成分的比例将十二烷基硫酸钠、乙醇、氯仿、醋酸钠、乙二胺四 乙酸、氯化钠用超纯水溶解和混合后，调节pH= 8.0,定容，然后置于灭菌瓶中在121°C、 0·IMpa灭菌 20min; (2) 灭菌后，加入2%的聚乙烯吡咯烷酮，得到混合液，备用； (3) 将禾本科植物新鲜叶片切割为截面不大于0. 5cm2的条块； (4) 使用前，向（2)中的混合液中加入β-巯基乙醇至终浓度为2%，制得保存液； (5) 将所述禾本科植物新鲜叶片条块浸没在（4)中的保存液中，常温保存； (6) 取步骤（5)保存有禾本科植物新鲜叶片条块的保存液在65°C下加热3-5min，再采 用常规SDS法提取基因组DNA。4. 如权利要求3所述的禾本科植物新鲜叶片的保存及基因组DNA的提取方法，其特征 在于，所述禾本科植物为狗牙根、结缕草或水稻。5. 如权利要求1所述的适用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片保存液或如权利 要求3所述的适用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片的保存方法在禾本科植物新鲜 叶片保存中的应用。6. 如权利要求1所述的适用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片保存液或如权利 要求3所述的适用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片的保存方法在提取禾本科植物 基因组DNA的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种适用于提取禾本科植物基因组DNA的新鲜叶片保存液及其保存方法和应用。本发明提供的保存液及其保存方法简单有效、成本低廉、适用于禾本科植物新鲜叶片的常温保存；本发明提供的保存液用于提取禾本科植物基因组DNA，能获得多糖、多酚、蛋白质等杂质含量低，高质量的DNA。
【IPC分类】C12N15/10, A01N3/00
【公开号】CN105248414
【申请号】CN201510866618
【发明人】黄春琼, 刘国道, 白昌军
【申请人】中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年12月1日