快速生产白及种苗的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种快速生产白及种苗的方 法。
【背景技术】
[0002] 兰科植物种子细小如尘，也称为"灰尘种子"，其种子海量，每一颗成熟的果实包含 数万粒以上可利用的种子，但在自然条件下，种子很难萌发。兰科植物是植物界进化程度 高，且与真菌有着密切联系的特殊生态类群。研究表明，无论是兰科植物的种子萌发，还是 植物的生长，都离不开菌根真菌;菌根真菌在兰科药用和观赏类植物的保护、引种驯化和人 工栽培中显得尤为重要。由于大多数兰科植物处于濒危状态，所有兰科植物的野生种都已 被列入《濒危野生动植物国际贸易公约》，是植物保护中的"旗舰"类群。因此，如何在生产中 有效地利用菌根真菌，已成为兰科植物大规模人工栽培、引种驯化和资源再生及保护的关 键限制性因子。
[0003] 白及为兰科多年生草本植物，其花色艳丽，极具观赏价值，还是目前我国濒危紧缺 的中药材，其根茎中富含药用成分白及胶质，具有治疗肺结核咯血、支气管扩张咯血、胃溃 疡吐血、尿血、便血等作用，疗效确切，经济价值很高。但由于自身特殊的生理特点及其生态 环境受到严重破坏，其资源几近枯竭。因此，如何实现白及资源的保护与资源再生，是一个 重要而急切的课题。
[0004] 目前，白及的繁殖方法主要有根茎分株繁殖和组织培养。传统的根茎分株繁殖速 度慢，生长周期长，效率低，种苗成本高，很难满足大面积的栽培需求;而组织培养生产的无 菌试管苗生长缓慢、移栽成活率低、抗逆性差、易感染病原菌。从目前情况看，白及繁殖困难 的状况还没有得到根本解决，导致野生白及资源几近枯竭，市场供不应求，严重限制了白及 临床用药和工业生产的需求。
[0005] 现有技术中，尚未有关于菌根真菌与兰科植物种子液体共生培养的报道。本技术 应用于白及种苗的快速生产及提高种苗的移栽成活率，同时可大幅降低生产成本，对于推 广白及规模化种植物，提高白及药材的质量和产量，保护白及资源具有重要的现实意义和 应用价值。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0007] 本发明还有一个目的是提供一种快速生产白及种苗的方法，通过将白及种子接种 于白及菌根真菌菌丝的菌液中共生培养，然后通过对共生培养得到的共生混合体进行包埋 处理，制作得到类似于人工种子的白及种苗，播种于育苗盘，接菌处理的种子在白及菌根真 菌作用下萌发形成具有根茎叶的完整植株。
[0008] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一株白及菌根真菌，所述白 及菌根真菌为蜡壳菌目（Sebacinales sp.)菌根真菌菌株YY-51，所述白及菌根真菌于2015 年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为GCMCC NO. 11104。
[0009] 本发明所述的快速生产白及种苗的方法，包括以下步骤：
[0010] 步骤一、菌液的制备:采用PDA固体培养基培养白及菌根真菌，然后将白及菌根真 菌接种至共生液体培养基中得到白及菌根真菌菌丝体的菌液；
[0011] 步骤二、共生混合体的制备:将经过预处理的白及种子接种至步骤一中得到的菌 液中，在摇床上进行共生培养，得到白及种子和白及菌根真菌的共生混合体；
[0012] 步骤三、白及种的包埋:待步骤二中所述白及种子萌发并形成原球茎和叶片后，将 所述共生混合体过滤，得共生培养后的白及种，并用包埋剂进行包埋，在包埋物表面喷洒 2.5~40g/L普鲁兰多糖溶液，即得白及种苗。
[0013] 优选的是，所述的快速生产白及种苗的方法，所述步骤一中所述共生液体培养基 为燕麦培养基、麦麸培养基、土豆培养基、苹果培养基、萝卜培养基、番薯培养基、或芋头培养 基；
[0014] 其中所述燕麦培养基的制作方法为：按2~20g/L的用量称取燕麦，加入500mL的 水，煮开后保持30min，4层纱布过滤后，定容至IL，调节pH值为5.1~5.3，即得燕麦培养基； [0015]所述麦麸培养基的制作方法为：按2~20 g//L的用量称取麦麸，加入500mL的水，煮 开后保持30min，4层纱布过滤后，定容至IL，调节pH值为5.1~5.3，即得麦麸培养基；
[0016]所述土豆培养基、苹果培养基、萝卜培养基、番薯培养基或芋头培养基的制作方法 为:称取5~200g/L 土豆、苹果、萝卜、番薯或芋头，切成小块，开水煮30分钟，4层纱布过滤后， 即得相应的培养基，然后置于高压121°C高温条件下灭菌20min，冷却后备用。
[0017]优选的是，所述的快速生产白及种苗的方法，所述步骤一中得到白及菌根真菌菌 丝体具体方法为:先采用固体培养基，培养温度为26~28°C，暗培养7~10天后，从形成 的菌落边缘挑取小块，接种到共生液体培养基中进行摇床暗培养3~5天，摇床转速为100~ 150r/min，培养温度为26~28°C。
[0018] 优选的是，所述的快速生产白及种苗的方法，所述白及种子的预处理的具体步骤 为：
[0019] 步骤a、取9~10月份的成熟的白及蒴果，用自来水洗净，然后依次用体积分数为 75%的酒精溶液浸泡30s和质量分数为2.5%氯酸钠溶液浸泡8~20min，取出白及蒴果用无 菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干水分，切开白及蒴果，取出白及种子；
[0020] 步骤b、将所述步骤a中得到的白及种子置于0.1~1.0%体积分数的双氧水溶液中 浸泡5~30min，取出白及种子用无菌水冲洗3次，然后将白及种子按0.5g/袋的规格分装入 网袋中，在所述网袋的外部套设布制的外袋，所述网袋与所述外袋的开口朝向同一方向，所 述外袋与所述网袋之间的空间内填充有0.1~〇.5g的粒径为0.1~0.2mm的细砂，所述网袋 的网格孔径小于白及种子的粒径；
[0021] 其中，所述外袋经过了预处理:将所述外袋在质量分数为1~3%的聚乙烯醇、1.2 ~1.8 %的氯化钙、0.5~0.8 %的硫酸镍和1.0~1.5 %的氯化锌的混合溶液中浸泡10~ 20min后晾干，重复浸泡1~3次后晾干使用；
[0022]步骤c、将所述网袋放入30~45°C的热水中浸泡5~lOmin，然后取出放入所述外袋 中封口后超声振荡5~lOmin，重复浸泡、超声振荡1~3次，取所述网袋中的白及种子，并用 无菌滤纸吸干水分，即得所述预处理的白及种子。
[0023] 优选的是，所述的快速生产白及种苗的方法，所述步骤二中所述的共生培养条件 为：摇床转速为100~200r/min，光照强度为2500~45001UX，温度为26~28°C，先光培养 l〇h，然后暗培养14h，光/暗交替培养。
[0024] 优选的是，所述的快速生产白及种苗的方法，所述包埋剂的制作方法为:用水或天 然提取液作为溶剂，配置质量分数为3~4%的为海藻酸钠溶液，加热使所述海藻酸钠溶液 成溶胶状态后，在高压121°C下灭菌20min，冷却后即得所述包埋剂；
[0025]其中，所述天然提取液为土豆、麦麸或燕麦的提取液。
[0026] 优选的是，所述的快速生产白及种苗的方法，所述步骤三中所述白及种的包埋的 具体操作方法为:在无菌条件下，将所述步骤二中共生培养获得的共生混合体过滤，将过滤 得到的白及种单独或与预培养的菌根真菌菌丝体一起悬浮于所述包埋剂中，获得种苗悬浮 液;然后用滴管吸取悬浮液，滴入已灭菌的2%氯化钙溶液中，约10~15min后，倒去氯化钙 溶液，用无菌水冲洗20min，即可完成种苗的包埋。
[0027] 优选的是，所述的快速生产白及种苗的方法，还包括：
[0028] 步骤四、白及种苗的育苗：在育苗盘中装入基质，在所述基质上放置壳斗科碎树 叶，将所述步骤三中得到的白及种苗播种在壳斗科碎树叶上，然后再覆盖厚度为0.2~ 0.5cm的基质，在所述基质上部喷洒一层体积比为1: 3: 5的椰汁、香蕉汁和番茄汁形成的混 合溶液，喷淋浇灌；
[0029] 其中，所述基质的组成为以下四种之一：质量比为1.5~2.5:1.5~2.5:1.0~2.0 的黄土、炭渣和椰壳;质量比为1:0.5~1:1~2的腐叶土、珍珠岩和松树叶;质量比为1:2~4 的蕨根和素红土或质量比为1~2:2~4的珍珠岩和泥炭土。
[0030] 本发明至少包括以下有益效果：
[0031] 1、本发明通过将白及种子接种于白及菌根真菌菌丝的菌液中共生培养，然后通过 对共生培养得到的共生混合体进行包埋处理，制作得到类似于人工种子的白及种苗，播种 于育苗盘，接菌处理的种子在白及菌根真菌作用下萌发形成具有根茎叶的完整植株;本发 明不需要加入任何激素和组培常用培养基如MS培养基、1/2MS培养基、N6培养基、B5培养基、 Knudson培养基等，而且在育苗及种植过程中也不需要加入任务杀菌剂，对环境友好，且生 产工艺简单，在菌根真菌培养和白及种子接种的过程中，需要无菌操作，其他流程则可以不 需要；另外，制作白及人工种子或种苗，容易保藏和运输，避免了传统组织培养过程中的操 作过程复杂、技术要求高、多次继代培养、移栽或定植过程需要大量人力和物力，生产成本 低。
[0032] 2、本发明种苗生产周期短，只需2周就可以获得白及原球茎，1个月即可获得白及 种苗，而且，菌根真菌诱导萌发的白及种苗，发育正常，苗整体质量优，移栽成活率达到95 % 以上，对于推广白及大规模育苗栽培具有广阔的应用前景和经济价值。
[0033] 3、本发明设计双层结构的网袋，在超声波的过程中，位于外袋与内袋之间的细砂 会与容纳与内袋中白及种子接触，在白及种子表面摩擦并留下细小的微孔，摩擦能够将休 眠的白及种子激活，细小的微孔使得白及种子在萌发之前和萌发过程中能够吸入更多的氧 气