快速生产白及种苗的方法_3

文档序号:9757491阅读:来源:国知局
/袋的规格分装入网袋中, 在所述网袋的外部套设布制的外袋,所述网袋与所述外袋的开口朝向同一方向,所述外袋 与所述网袋之间的空间内填充有〇.5g的粒径为0.2mm的细砂,所述网袋的网格孔径小于白 及种子的粒径;
[0094]其中,所述外袋经过了预处理:将所述外袋在质量分数为3 %的聚乙烯醇、1.8 %的 氯化钙、0.8%的硫酸镍和1.5%的氯化锌的混合溶液中浸泡20min后晾干,重复浸泡1~3次 后晾干使用;
[0095]步骤c、将所述网袋放入45°C的热水中浸泡lOmin,然后取出放入所述外袋中封口 后超声振荡lOmin,重复浸泡、超声振荡1~3次,取出所述网袋中的白及种了,并用无菌滤纸 吸干水分,即得所述预处理的白及种子;
[0096] 步骤三、白及种的包埋:待步骤二中所述白及种子萌发并形成原球茎和叶片后,将 所述共生混合体过滤,得共生培养后的白及种,将过滤得到的白及种单独或与预培养的菌 根真菌菌丝体一起悬浮于所述包埋剂中,获得种苗悬浮液;然后用滴管吸取悬浮液,滴入已 灭菌的2%氯化钙溶液中,约15min后,倒去氯化钙溶液,用无菌水冲洗20min,即可完成种苗 的包埋,在包埋物表面喷洒40g/L普鲁兰多糖溶液,即得白及种苗;
[0097] 其中所述包埋剂的制作方法为:用水或天然提取液作为溶剂,配置质量分数为4% 的为海藻酸钠溶液,加热使所述海藻酸钠溶液成溶胶状态后,在高压121°C下灭菌20min,冷 却后即得所述包埋剂;
[0098] 其中,所述天然提取液为土豆、麦麸或燕麦的提取液;
[0099] 步骤四、白及种苗的育苗:在育苗盘中装入基质,在所述基质上放置壳斗科碎树 叶,将所述步骤三中得到的白及种苗播种在壳斗科碎树叶上,然后再覆盖厚度为〇. 5cm的基 质,在所述基质上部喷洒一层体积比为1:3:5的椰汁、香蕉汁和番茄汁形成的混合溶液,喷 淋浇灌;
[0100] 其中,所述基质的组成为以下四种之一:质量比为2.5:2.5:2.0的黄土、炭渣和椰 壳;质量比为1:1:2的腐叶土、珍珠岩和松树叶;质量比为1:4的蕨根和素红土或质量比为2: 4的珍珠岩和泥炭土。
[0101] 实施例3
[0102] 本发明所述的快速生产白及种苗的方法,包括以下步骤:
[0103]步骤一、菌液的制备:白及菌根真菌接种至I3DA固体培养基中,控制培养温度为26 °C,暗培养7天,然后从形成的菌落边缘挑取小块,接种到共生液体培养基中进行摇床暗培 养3天,摇床转速为100r/min,培养温度为26°C,得到白及菌根真菌菌丝体的菌液;
[0104] 其中,所述共生液体培养基为燕麦培养基、麦麸培养基、土豆培养基、苹果培养基、 萝卜培养基、番薯培养基、或芋头培养基;
[0105] 其中所述燕麦培养基的制作方法为:按2g/L的用量称取燕麦,加入500mL的水,煮 开后保持30min,4层纱布过滤后,定容至IL,调节pH值为5.1,即得燕麦培养基;
[0106] 所述麦麸培养基的制作方法为:按2g/L的用量称取麦麸,加入500mL的水,煮开后 保持30min,4层纱布过滤后,定容至IL,调节pH值为5.1,即得麦麸培养基;
[0107]所述土豆培养基、苹果培养基、萝卜培养基、番薯培养基或芋头培养基的制作方法 为:称取5g/L 土豆、苹果、萝卜、番薯或芋头,切成小块,开水煮30分钟,4层纱布过滤后,即得 相应的培养基,然后置于高压121°C高温条件下灭菌20min,冷却后备用。
[0108] 步骤二、共生混合体的制备:将经过预处理的白及种子接种至步骤一中得到的菌 液中,在摇床上进行共生培养,所述共生培养的条件为:摇床转速为l〇〇r/min,光照强度为 25001UX,温度为26°C,先光培养IOh,然后暗培养14h,光/暗交替培养,得到白及种子和白及 菌根真菌的共生混合体;
[0109] 其中,所述白及种子的预处理的具体操作步骤为:
[0110]步骤a、取9~10月份的成熟的白及蒴果,用自来水洗净,然后依次用体积分数为 75%的酒精溶液浸泡30s和质量分数为2.5%氯酸钠溶液浸泡8min,取出白及蒴果用无菌水 冲洗3次,无菌滤纸吸干水分,切开白及蒴果,取出白及种子;
[0111] 步骤b、将所述步骤a中得到的白及种子置于0.1 %体积分数的双氧水溶液中浸泡 5min,取出白及种子用无菌水冲洗3次,然后将白及种子按0.5g/袋的规格分装入网袋中,在 所述网袋的外部套设布制的外袋,所述网袋与所述外袋的开口朝向同一方向,所述外袋与 所述网袋之间的空间内填充有0.1 g的粒径为0.1mm的细砂,所述网袋的网格孔径小于白及 种子的粒径;
[0112] 其中,所述外袋经过了预处理:将所述外袋在质量分数为1%的聚乙烯醇、1.2%的 氯化钙、0.5%的硫酸镍和1.0%的氯化锌的混合溶液中浸泡IOmin后晾干,重复浸泡1次后 晾干使用;
[0113] 步骤c、将所述网袋放入30°C的热水中浸泡5min,然后取出放入所述外袋中封口后 超声振荡5min,重复浸泡、超声振荡1~3次,取出所述网袋中的白及种子,并用无菌滤纸吸 干水分,即得所述预处理的白及种子;
[0114] 步骤三、白及种的包埋:待步骤二中所述白及种子萌发并形成原球茎和叶片后,将 所述共生混合体过滤,得共生培养后的白及种,将过滤得到的白及种单独或与预培养的菌 根真菌菌丝体一起悬浮于所述包埋剂中,获得种苗悬浮液;然后用滴管吸取悬浮液,滴入已 灭菌的2%氯化钙溶液中,约IOmin后,倒去氯化钙溶液,用无菌水冲洗20min,即可完成种苗 的包埋,在包埋物表面喷洒2.5g/L普鲁兰多糖溶液,即得白及种苗;
[0115] 其中所述包埋剂的制作方法为:用水或天然提取液作为溶剂,配置质量分数为3% 的为海藻酸钠溶液,加热使所述海藻酸钠溶液成溶胶状态后,在高压121°C下灭菌20min,冷 却后即得所述包埋剂;
[0116] 其中,所述天然提取液为土豆、麦麸或燕麦的提取液;
[0117] 步骤四、白及种苗的育苗:在育苗盘中装入基质,在所述基质上放置壳斗科碎树 叶,将所述步骤三中得到的白及种苗播种在壳斗科碎树叶上,然后再覆盖厚度为〇. 2cm的基 质,在所述基质上部喷洒一层体积比为1:3:5的椰汁、香蕉汁和番茄汁形成的混合溶液,喷 淋浇灌;
[0118] 其中,所述基质的组成为以下四种之一:质量比为1.5:1.5:1.0的黄土、炭渣和椰 壳;质量比为1:0.5:1的腐叶土、珍珠岩和松树叶;质量比为1:2的蕨根和素红土或质量比为 1:2的珍珠岩和泥炭土。
[0119] 实施例4
[0120] 本发明所述的快速生产白及种苗的方法,包括以下步骤:
[0121] 步骤一、菌液的制备:白及菌根真菌接种至TOA固体培养基中,控制培养温度为27 °C,暗培养9天,然后从形成的菌落边缘挑取小块,接种到共生液体培养基中进行摇床暗培 养4天,摇床转速为130r/min,培养温度为27°C,得到白及菌根真菌菌丝体的菌液;
[0122 ]其中,所述共生液体培养基为燕麦培养基、麦麸培养基、土豆培养基、苹果培养基、 萝卜培养基、番薯培养基、或芋头培养基;
[0123] 其中所述燕麦培养基的制作方法为:按I lg/L的用量称取燕麦,加入500mL的水,煮 开后保持30min,4层纱布过滤后,定容至IL,调节pH值为5.2,即得燕麦培养基;
[0124] 所述麦麸培养基的制作方法为:按I lg/L的用量称取麦麸,加入500mL的水,煮开后 保持30min,4层纱布过滤后,定容至IL,调节pH值为5.2,即得麦麸培养基;
[0125] 所述土豆培养基、苹果培养基、萝卜培养基、番薯培养基或芋头培养基的制作方法 为:称取102g/L 土豆、苹果、萝卜、番薯或芋头,切成小块,开水煮30分钟,4层纱布过滤后,即 得相应的培养基,然后置于高压121°C高温条件下灭菌20min,冷却后备用。
[0126] 步骤二、共生混合体的制备:将经过预处理的白及种子接种至步骤一中得到的菌 液中,在摇床上进行共生培养,所述共生培养的条件为:摇床转速为150r/min,光照强度为 35001UX,温度为27°C,先光培养IOh,然后暗培养14h,光/暗交替培养,得到白及种子和白及 菌根真菌的共生混合体;
[0127] 其中,所述白及种子的预处理的具体操作步骤为:
[0128] 步骤a、取9~10月份的成熟的白及蒴果,用自来水洗净,然后依次用体积分数为 75%的酒精溶液浸泡30s和质量分数为2.5 %氯酸钠溶液浸泡Hmin,取出白及蒴果用无菌 水冲洗3次,无菌滤纸吸干水分,切开白及蒴果,取出白及种子;
[0129] 步骤b、将所述步骤a中得到的白及种子置于0.5%体积分数的双氧水溶液中浸泡 18min,取出白及种子用无菌水冲洗3次,然后将白及种子按0.5g/袋的规格分装入网袋中, 在所述网袋的外部套设布制的外袋,所述网袋与所述外袋的开口朝向同一方向,所述外袋 与所述网袋之间的空间内填充有〇.3g的粒径为0.15_的细砂,所述网袋的网格孔径小于白 及种子的粒径;
[0130]其中,所述外袋经过了预处理:将所述外袋在质量分数为2%的聚乙烯醇、1.5%的 氯化钙、0.7%的硫酸镍和1.3 %的氯化锌的混合溶液中浸泡15min后晾干,重复浸泡2次后 晾干使用;
[0131] 步骤c、将所述网袋放入38°C的热水中浸泡8min,然后取出放入所述外袋中封口后 超声振荡8min,重复浸泡、超声振荡2次,取出所述网袋中的白及种子,并用无菌滤纸吸干水 分,即得所述预处理的白及种子;
[0132] 步骤三、白及种的包埋:待步骤二中所述白及种子萌发并形成原球茎和叶片后,将 所述共生混合体过滤,得共生培养后的白及种,将过滤得到的白及种单独或与预培养的菌
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