剂盒。根据 本发明的实施例，该试剂盒包含前述的巨核祖细胞冻存液。发明人惊奇的发现，该试剂盒能 够有效用于冻存巨核祖细胞，细胞复苏后存活率和回收率高。
[0029] 根据本发明的又一方面，本发明提供了一种冻存巨核祖细胞的方法。根据本发明 的实施例，利用前述的巨核祖细胞冻存液或者前述的试剂盒，冻存所述巨核祖细胞。根据本 发明实施例的冻存巨核祖细胞的方法，该方法能够有效用于冻存巨核祖细胞，细胞复苏后 存活率和回收率高。
[0030] 根据本发明的实施例，每105-107个巨核祖细胞采用lml所述巨核祖细胞冻存液。由 此，能够有效实现巨核祖细胞的冻存。根据本发明的优选实施例，每1〇 6个巨核祖细胞采用 lml所述巨核祖细胞冻存液。由此，细胞冻存效果好。
[0031] 根据本发明的实施例，于液氮中进行所述冻存。由此，有利于细胞长期保持，对细 胞的保护作用好。
[0032] 根据本发明的一些实施例，本发明的冻存巨核祖细胞的方法可以包括:将巨核祖 细胞与本发明的巨核祖细胞冻存液混合后，于液氮中进行冻存。
[0033] 根据本发明的一些具体示例，可以按照以下步骤冻存巨核祖细胞:将本发明的巨 核祖细胞冻存液与待冻存的巨核祖细胞混匀后，速移入冻存管，并放入冻存盒中，_70°C梯 度降温过夜，次日转入液氮内保存。
[0034] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的 实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条 件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪 器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0035] 实施例1
[0036]发明人分别采用仅含DMS0和培养基的冻存液、市售的07930冻存液，不含血浆而含 有HSA的冻存液，以及本发明的含有血浆的冻存液共7种，分别对体外诱导扩增的巨核祖细 胞进行冻存，比较冻存效果，以便观察脐血浆和泊洛沙姆对巨核祖细胞冻存保存的影响，具 体如下：
[0037] 1、实验方法
[0038] (1)分离获得脐带血单个核细胞，体外诱导扩增巨核祖细胞10天，获得扩增后的巨 核祖细胞。
[0039] (2)将上述体外诱导扩增第10天获得的巨核祖细胞，分别采用七种冻存液进行冻 存，其中，七种冻存液的成份见表1，冻存液的剩余体积的均为MDM(或Stemspan)培养基。其 中，冻存方法如下:将冷冻保存液与细胞混匀后，速移入冻存管，并放入冻存盒中，-70°C梯 度降温过夜，次日转入液氮内。其中，每lml冻存液，冻存细胞数为6 X 106。
[0040] (3)冷冻保存巨核祖细胞30天，然后进行复苏。
[0041] (4)检测冻存前后细胞的存活率、细胞数以及复苏后细胞回收率。具体地，冻存前 以及冻存并复苏后的细胞存活率计算方法为:【活细胞数/(活细胞数+死细胞数)】χ 100%。 细胞回收率计算方法:【冻存复苏后活细胞数/冻存前活细胞数】X 100%。
[0042] 2、实验结果
[0043] 结果表明，第5组冻存液（10%DMS0+80%血浆+pl88)和第6组冻存液（10%DMS0+ 80%血浆)保存细胞存活率高，而加入pl88可回收更多的细胞。实验结果说明冻存液中含有 血浆能够高效地提高细胞的存活率，并且回收的细胞数量多，而泊洛沙姆能进一步提高细 胞的存活率和回收的细胞数量。
[0044] 表1不同冻存液对体外诱导10天的巨核祖细胞冷冻保存效果的影响(n = 3)
[0045]
[0046] 实施例2
[0047] 按照实施例1的方法对巨核祖细胞进行冻存，不同的是冻存的细胞是体外诱导14 天的巨核祖细胞，以及部分冻存液的成份不同，冻存液的具体成份见表2。
[0048] 表2不同冻存液对体外诱导14天的巨核祖细胞冷冻保存效果的影响(n = 3)
[0049]
[0050] 结果表明，血浆能够高效地提高冻存液的存活率，并且回收的细胞数量多，并且在 一定范围内，随着血浆浓度的增加，细胞的存活率和回收的细胞数也增加。并且，P188和 P407在一定程度上能进一步提高细胞的存活率和回收的细胞数量。
[0051]在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何 的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0052]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解:在不 脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本 发明的范围由权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1. 一种巨核祖细胞冻存液，其特征在于，包括： DMSO;和 血浆。2. 根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述DMSO的浓度为（5-15)体积％，优选 地，为10体积％。3. 根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述血浆的浓度为(30-90)体积％，优选 地，为80体积％。4. 根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，进一步包括泊洛沙姆， 任选地，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188或泊洛沙姆407， 任选地，所述泊洛沙姆188的浓度为0.2-lmg/ml，优选地，为0.5mg/ml， 任选地，所述泊洛沙姆407的浓度为0.2-lmg/ml，优选地，为0.5mg/ml。5. 根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，当所述DMSO和所述血浆的体积百分数之 和小于1时，所述巨核祖细胞冻存液进一步包含剩余体积的頂DM或Stemspan培养基。6. 根据权利要求1所述冻存液，其特征在于，所述血浆为自体血浆。7. -种用于冻存巨核祖细胞的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-6任一项所述的巨 核祖细胞冻存液。8. -种冻存巨核祖细胞的方法，其特征在于， 利用权利要求1-6任一项所述的巨核祖细胞冻存液或者权利要求7所述的试剂盒，冻存 所述巨核祖细胞。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，每105-107个巨核祖细胞采用lml所述巨核 祖细胞冻存液，优选地，每1〇 6个巨核祖细胞采用lml所述巨核祖细胞冻存液。10. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，于液氮中进行所述冻存。
【专利摘要】本发明公开了巨核祖细胞冻存液及其应用。其中，该巨核祖细胞冻存液包括：DMSO和血浆。该冻存液能够有效用于冻存巨核祖细胞，细胞复苏后存活率和回收率高。
【IPC分类】A01N1/02
【公开号】CN105613484
【申请号】CN201510945651
【发明人】裴雪涛, 陈琳, 刘大庆, 岳 文, 李雪, 潘志婷, 黄安平, 陈志清, 吕洋
【申请人】军事医学科学院华南干细胞与再生医学研究中心
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2015年12月16日