本发明涉及天然植物提取物领域，具体是一种连翘叶提取物在阻断N-亚硝胺形成中的应用。
背景技术：
N-亚硝胺是世界公认的四大食品污染物之一，一系列研究表明N-亚硝胺可诱使有机体发生基因突变，具有致畸性和强致癌性，主要可引起食管癌、胃癌、肝癌和大肠癌等。因此，如何抑制N-亚硝胺在体内外的合成，以及减少其对人类和环境的危害是当今研究的主要热点。目前，使用外源性食品添加剂、食品配料以及植物营养素是控制食品中N-亚硝胺形成的主要措施，通过植物来源的生物黄酮类或生物多酚等天然抗氧化剂阻断N-亚硝胺形成是目前研究的热点。
连翘叶是木犀科连翘属植物连翘的干燥叶，含有丰富的生物多酚类成分，并具有较强的抗氧化活性，因此，在民间连翘叶主要用于制作连翘叶茶，具有清热解毒、下火等功效。而且长期使用连翘叶茶的结果表明连翘叶未发现毒副作用。基于以上原因，本发明提供一种连翘叶提取物在阻断N-亚硝胺形成和清除亚硝酸盐中的应用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种连翘叶提取物在阻断N-亚硝胺形成中的应用，以及提供一种连翘叶提取物在清除亚硝酸盐中的应用。
本发明提供的一种连翘叶提取物在阻断N-亚硝胺形成中的应用。
本发明提供的一种连翘叶提取物在清除亚硝酸盐中的应用。
所述的连翘叶提取物，是以连翘叶为原料，经水提取、大孔树脂分离有效组分制备而成。提取物中有效部位多酚含量为40％以上(总酚含量以没食子酸当量计算)，连翘叶提取物具体制备方法，包括如下步骤：
(1)提取：取干燥连翘叶、粉碎，加入8～10倍量去离子水，加热至微沸提取2-3次，每次提取0.5-1.5h，过滤，合并滤液，60℃减压浓缩至比重为1.05～1.10的连翘叶提取液；
(2)分离：将连翘叶提取液载入非极性或弱极性大孔吸附树脂柱中，分别用水和20％乙醇水溶液依次淋洗2～4个柱体积至淋洗液呈浅黄色，再用40％乙醇水溶液淋洗2～4个柱体积，收集40％乙醇水溶液淋洗液，60℃减压浓缩干燥，得连翘叶有效部位。利用福林酚法测定有效部位提取物中的总多酚含量，连翘叶的有效部位中总多酚的含量在40％以上(总酚含量以没食子酸当量计算)。
步骤(2)中所述的非极性或弱极性大孔吸附树脂柱的材料，可为非极性大孔吸附树脂D101或弱极性大孔吸附树脂AB-8的任意一种。
经实验证明，所获得的连翘叶有效部位对亚硝酸钠具有清除作用、对亚硝胺的形成具有阻断作用。
将上述获得的连翘叶有效部位作为活性组分，可以进一步与其他载体、赋型剂等混合应用于预防体内N-亚硝胺产生所导致的癌变风险的保健食品组合物，剂型可以是液体、胶囊、颗粒剂等形式。
将上述获得的连翘叶有效部位作为活性组分，可以进一步与载体、赋型剂混合制成用于阻断食品储存过程中N-亚硝胺产生的食品添加剂，剂型可以是液体、颗粒剂等形式。
所述的载体可为乳糖、蔗糖、山梨醇、淀粉、聚乙二醇、明胶、去离子水等。还可加入润滑剂、矫味剂、悬浮剂等赋型剂。
本发明具有如下优点：
本发明是以连翘叶为原料，经水提取、大孔树脂分离有效组分制备而成的提取物，提取物中多酚含量为40％以上(总酚含量以没食子酸当量计算)。提取物对亚硝酸钠具有明显的清除作用、对N-亚硝胺的形成具有较好的阻断作用，阻断效果与维生素C相当，且无毒副作用。提取物可望在阻断N-亚硝胺形成中的应用，以及在清除亚硝酸盐中的应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的保护范围。
实施例1 连翘叶提取物的制备
取干燥连翘叶、粉碎，加入原材料量10倍量的去离子水，加热至微沸提取两次，每次提取1h，过滤，合并两次滤液，60℃减压浓缩至比重为1.05～1.10的连翘叶提取液，用D101大孔吸附树脂柱层析分离，分别用水和20％乙醇水溶液依次淋洗3个柱体积至淋洗液呈浅黄色，再用40％乙醇水溶液淋洗3个柱体积，收集40％乙醇水溶液淋洗液，60℃减压浓缩干燥，得连翘叶有效部位提取物。利用福林酚法测定有效部位提取物中的总多酚含量，有效部位提取物中总多酚含量为45.4％(总酚含量以没食子酸当量计算)。
实施例2 连翘叶提取物的制备
取干燥连翘叶、粉碎，加入原材料量9倍量的去离子水，加热至微沸提取两次，每次提取1h，过滤，合并两次滤液，60℃减压浓缩至比重为1.05～1.10的连翘叶提取液，用AB-8大孔吸附树脂柱层析分离，分别用水和20％乙醇水溶液依次淋洗4个柱体积至淋洗液呈浅黄色，再用40％乙醇水溶液淋洗4个柱体积，收集40％乙醇水溶液淋洗液，60℃减压浓缩干燥，得连翘叶有效部位提取物。利用福林酚法测定有效部位提取物中的总多酚含量，有效部位提取物中总多酚含量为48.5％(总酚含量以没食子酸当量计算)。
实施例3 连翘叶提取物对亚硝酸盐的清除作用
将Vc和按实施例1制备的连翘叶提取物用50％乙醇配制成不同浓度的溶液，现用现配。取1mL柠檬酸钠-盐酸缓冲液(pH＝3，0.5M)置于10mL容量瓶中，取0.5mL不同浓度的Vc或样品依次加入容量瓶中，再分别加入1mL 10μg/mL的NaNO2溶液，在37℃恒温水浴中反应30min，取出后立即加入0.4mL 0.4％对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置5min后加入0.2mL0.2％盐酸萘乙二胺溶液，加缓冲液到刻度，混匀，静置15min，于538nm处测定吸光度值，平行测定三次。同时各做3份NaNO2标准管和清除剂本底标准管。用下式计算清除率。结果见表1。
式中：A0为未加清除剂的标准管吸光度；Ax为加入不同浓度清除剂的反应液吸光度；Axi为加入不同浓度清除剂本底的吸光度。
表1阻断剂对亚硝酸盐的清除作用
结果表明：按实施例1制备的连翘叶提取物对亚硝酸盐具有清除作用。
实施例4 连翘叶提取物对N-亚硝胺形成的阻断作用
基于高效液相色谱法分析NaNO2和盐酸二甲胺反应生成的N-亚硝基二甲胺(NDMA)量。色谱条件：Agilent 1260高效液相色谱系统，Zorbax XDBC18(250mm*4.6mm,5μm)反相色谱柱，进样量15μL，柱温35℃，流动相为甲醇-水(10：90，V/V)，流速1mL/min，检测波长230nm。
取2mL不同浓度按实施例1制备的连翘叶提取物的DMSO溶液和7mL柠檬酸钠-盐酸缓冲液(pH＝3，0.1M)置于10mL棕色容量瓶中，加入0.5mL盐酸二甲胺(0.4M)和0.5mL NaNO2(0.1M)，在37℃水浴中反应4h。取出后立即加入100μL氨基磺酸铵(0.4M)终止亚硝化反应。取1mL反应液，用1.5mL的二氯甲烷萃取，萃取液用0.45μm滤膜过滤，HPLC分析。以2mL DMSO代替样品作为空白对照，按上述实验方法，平行三次。用下式计算阻断率。结果见表1。
式中：Px为加入按实施例1制备的连翘叶提取物的峰面积；Pb为不加样品的峰面积。
结果表明：按实施例1制备的连翘叶提取物对N-亚硝胺形成具有阻断作用。