本发明属于食品领域，具体涉及一种岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术：
岩藻黄素是存在于褐藻中的叶黄素类物质，具有视力保护、保肝、调节脂代谢等多种生物活性。然而，独特的长链共轭结构(含丙二烯结构)导致岩藻黄素的稳定性差，极易受到高温、氧气、光照等条件的破坏，难以在食品生产中应用；此外，岩藻黄素的脂溶性特点令其难以在食品亲水体系中均匀分散，造成了人体吸收的多重屏障，难以发挥其独特的生理活性。因此，提高岩藻黄素的稳定性、促进人体对岩藻黄素的吸收利用是实施岩藻黄素产业化开发的技术关键。
常规微胶囊包埋技术通常强调了对类胡萝卜素的包载量、溶解性与稳定性的改善，却忽视了人体的吸收效果，违背了营养强化的初衷。例如，浙江新昌制药厂生产的β-胡萝卜素水分散性干粉10％cws以及β-胡萝卜素乳液1％，这些产品可直接用于饮料、液体食品等的着色和营养强化。但是，当前的类胡萝卜素制剂仍有诸多不足，主要表现为：(1)存在安全隐患，产品中残留有机溶剂；(2)吸收困难，类胡萝卜素微胶囊化制剂的粒径在0.7～5μm之间；(3)生产效率低，生产过程中类胡萝卜素有较多损失。为了弥补微胶囊技术的不足，近年来，国内外研究者开始利用微/纳米乳液和生物大分子对类胡萝卜素进行包埋，如自乳化载体、纳米自乳化载体、纳米粒以及纳米乳化复合体系等。江南大学麻建国课题组以食品生物大分子辛烯基琥珀酸酯化淀粉为乳化剂，构建水包油(o/w)型β-胡萝卜素纳米乳液；salvia-trujillo等(2013)利用玉米油-吐温20为β-胡萝卜素载体；tian等(2014)采用卵磷脂-壳聚糖为载体制备叶黄素纳米脂质体，有效提高了叶黄素的加工稳定性；huang研究团队(2010)还将壳聚糖分子结构中接入辛酰基和聚乙二醇单甲醚基团得到改性壳聚糖，并用于类胡萝卜素的运载，以提高其生物利用度。另外，中国农业大学高彦祥研究团队还采用了高压均质法制备了基于tween系列表面活性剂β-胡萝卜素纳米乳液(yuanetal.,2008；qianetal.,2012)。然而，这些技术在追求类胡萝卜素的高载量和高生物利用度的同时，却忽略了产品的稳定性、安全性与生产工艺的经济性。例如，当tween80浓度(小于100nm)达到4mg/ml时溶血系数可达60％(leeetal.,2003；gongetal.,2009)，而此浓度还远远低于tween80在纳米乳液配方中的一般浓度(10～50mg/ml)；而高压均质等技术对设备要求较高，生产成本较高。
技术实现要素：
本发明针对岩藻黄素因难溶于水、稳定性差、吸收率低导致的加工适性差、应用局限大的难题，通过对现有加工方法的改进，提供了一种水溶性好、稳定性强、吸收率高的岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒及其制备方法和应用。
具体地，本发明提供了一种岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)将牡蛎肽采用水溶解，并将ph值调节至10～12，以打开牡蛎肽疏水内腔，得到碱性牡蛎肽水溶液；
(2)将岩藻黄素粉末用氢氧化钠乙醇溶液溶解，加入脂肪酸混匀，得到岩藻黄素-脂肪酸分散液；
(3)将所述碱性牡蛎肽水溶液与所述岩藻黄素-脂肪酸分散液混匀，超声处理，使岩藻黄素与牡蛎肽疏水内腔充分结合；
(4)将步骤(3)所得溶液的ph值调回至6～8，以封闭牡蛎肽内腔，得到澄清的岩藻黄素-牡蛎肽复合物水溶液；
(5)将所述岩藻黄素-牡蛎肽复合物水溶液直接喷雾干燥，或经减压浓缩后冷冻干燥，得到岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒干粉。
优选地，步骤(1)中，所述牡蛎肽的分子量为1000～5000da。
优选地，步骤(1)中，所述牡蛎肽和水的用量使所得牡蛎肽溶液的浓度为0.5～8wt％。
优选地，步骤(2)中，所述氢氧化钠乙醇溶液中氢氧化钠的浓度为0.1～1wt％。
优选地，步骤(2)中，所述岩藻黄素与氢氧化钠乙醇溶液的用量比为1g:(100～300)μl。
优选地，步骤(2)中，所述岩藻黄素-脂肪酸分散液中岩藻黄素的浓度为30wt％。
优选地，步骤(2)中，所述脂肪酸为不饱和脂肪酸，其具有分子体积小、结构有柔性的特点。所述不饱和脂肪酸优选选自油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸中的至少一种。
优选地，步骤(3)中，所述岩藻黄素-脂肪酸分散液与以牡蛎肽计的所述碱性牡蛎肽水溶液的质量比为20:1～1:10。
优选地，步骤(3)中，所述超声处理的时间为0.5～2小时。
优选地，步骤(4)中，将所得溶液的ph值调回至6～8所采用的的试剂为酸味剂，所述酸味剂选自醋酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、苹果酸和葡萄糖酸内酯中的至少一种。
本发明还提供了由上述方法制备得到的岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒。
优选地，所述岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒在常温下放置12个月不会出现絮凝或分层现象且岩藻黄素的保留率为90％以上，在常温下放置24个月岩藻黄素的保留率为90％以上。
优选地，所述岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒复溶于水后的平均粒径为50～100nm，在660nm处的透光率为98％以上。
优选地，所述岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒在水体系中能够将岩藻黄素的吸收率提高4.52倍～6.18倍。
优选地，所述岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒中岩藻黄素的包埋率为85％以上。
所述岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒粉末便于储存运输，吸收效果好，营养效价高，可作为营养强化剂广泛用于饮料、烘焙食品、糖果、奶制品、雪糕等食品体系中。相应地，本发明还提供了所述岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒作为食品营养强化剂的应用。
本发明的发明人经过深入研究之后发现，锌元素能够促进类胡萝卜素营养物质的吸收效率。因此，本发明通过岩藻黄素与富含有机态锌的牡蛎肽进行配伍，这样能够提高岩藻黄素的吸收与靶向递送效率。此外，本发明通过蛋白自组装纳米技术作为提高岩藻黄素吸收效率与稳定性的有效手段，进一步提高了产品的视力保护功效。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：采用本发明提供的方法得到的岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒兼具了微胶囊与纳米乳液的优点，具有稳定性强、吸收效果好、生产工艺简单、无化学残留的特点。本发明方法充分利用了疏水分子相似相容、蛋白肽结构在ph循环条件下的可逆变化性质，使岩藻黄素的包埋率达到85％以上；本发明选用分子体积较小、结构柔性的不饱和脂肪酸作为介质，使得岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒的粒径在50～100nm，远远小于微胶囊化的粒径，同时，牡蛎肽中含有丰富的锌和硒元素，进一步促进了岩藻黄素的吸收，从而大幅提高了产品在水体系中的吸收效率，吸收效率可提高4.52倍～6.18倍；由于制备的岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒为粉末状，稳定性好，不仅便于储存运输，还具有比纳米乳液更稳定的优势，在常温下存放24个月，岩藻黄素的保留率可达到90％以上；所制备的岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒的复水性好，能在水溶液中形成澄清透明的液体，在660nm处的透光率为98％以上，扩大了产品的应用范围，使其在食品与生物医药领域具有广泛的用途；制备方法路线简单、不需要高压均质以及高速剪切加工，具有生产成本低的优势，适合产业化生产；此外，在制备岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒的过程中，所用原材料在食品中无任何添加限制，不存在有毒有害物质残留，产品安全性高，符合食品安全要求。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
(1)称取0.5g平均分子量为1000da的牡蛎肽，加入99.5ml去离子水，充分搅拌溶解，用氢氧化钠调节ph值至12，得到浓度为0.5wt％的碱性牡蛎肽溶液；
(2)称取3.0g的岩藻黄素粉末，加入300μl的1.0wt％氢氧化钠乙醇溶液充分溶解，然后加入7.0g的油酸，搅拌均匀，得到岩藻黄素浓度为30wt％的岩藻黄素分散液；
(3)将10.0g岩藻黄素分散液缓慢加入到步骤(1)所得的全部碱性牡蛎肽溶液中，搅拌均匀，超声处理2小时，使岩藻黄素与牡蛎肽疏水内腔充分结合；
(4)将步骤(3)所得溶液的ph值用葡萄糖酸内酯调回至7.0，得到岩藻黄素-牡蛎肽复合物水溶液(岩藻黄素包埋率为85％)；
(5)将所述岩藻黄素-牡蛎肽复合物水溶液直接喷雾干燥，或经减压浓缩后冷冻干燥，得到岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒干粉。
考察该岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒干粉的物化性质与吸收效果，具体地：将其复溶于去离子水后，形成澄清透明的溶液，平均粒径为100nm，在660nm处的透光率为98％，在常温下储藏12个月不会出现絮凝或分层现象且岩藻黄素的保留率为91.3％，在常温下储藏24个月岩藻黄素的保留率为90.2％；将该岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒干粉溶于去离子水后(0.2μmol/ml)(处理组)，灌胃小鼠，以未与牡蛎肽结合的岩藻黄素作为对照(对照组)，4小时后，分析小鼠血浆中的岩藻黄素含量，与对照组相比(91.3pmol/ml)，处理组小鼠血浆中的岩藻黄素含量达到570.6pmol/ml，提高了5.25倍。
实施例2
(1)称取1.5g平均分子量为3000da的牡蛎肽，加入98.5ml去离子水，充分搅拌溶解，用氢氧化钠调节ph值至11，得到浓度为1.5wt％的碱性牡蛎肽溶液；
(2)称取4.5g的岩藻黄素粉末，加入450μl的1.0wt％氢氧化钠乙醇溶液充分溶解，然后加入10.5g的亚油酸，搅拌均匀，得到岩藻黄素浓度为30wt％的岩藻黄素分散液；
(3)将15.0g岩藻黄素分散溶液缓慢加入到步骤(1)所得的全部碱性牡蛎肽溶液中，搅拌均匀，超声处理1小时，使岩藻黄素与牡蛎肽疏水内腔充分结合；
(4)将步骤(3)所得溶液的ph值用葡萄糖酸内酯调回至7.0，得到岩藻黄素-牡蛎肽复合物水溶液(岩藻黄素包埋率为86％)；
(5)将所述岩藻黄素-牡蛎肽复合物水溶液直接喷雾干燥，或经减压浓缩后冷冻干燥，得到岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒干粉。
考察该岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒干粉的物化性质与吸收效果，具体地：将其复溶于去离子水后，形成澄清透明的溶液，平均粒径为78nm，在660nm处的透光率为98％，在常温下储藏12个月不会出现絮凝或分层现象且岩藻黄素的保留率为91.7％，在常温下储藏24个月岩藻黄素的保留率为92.2％；将该岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒干粉溶于去离子水后(0.2μmol/ml)(处理组)，灌胃小鼠，以未与牡蛎肽结合的岩藻黄素作为对照(对照组)，4小时后，分析小鼠血浆中的岩藻黄素含量，与对照组相比(91.3pmol/ml)，处理组小鼠血浆中的岩藻黄素含量达到655.5pmol/ml，提高了6.18倍。
实施例3
(1)称取4.0g平均分子量为5000da的牡蛎肽，加入96ml去离子水，充分搅拌溶解，用氢氧化钠调节ph值至10，得到浓度为4.0wt％的碱性蛋白质溶液；
(2)称取1.2g的岩藻黄素粉末，加入240μl的0.5wt％氢氧化钠乙醇溶液充分溶解，然后加入2.8g的亚麻酸，搅拌均匀，得到岩藻黄素浓度为30wt％的岩藻黄素分散液；
(3)将4.0g岩藻黄素分散液缓慢加入到步骤(1)所得的全部碱性蛋白质溶液中，搅拌均匀，超声处理1.5小时，使岩藻黄素与牡蛎肽疏水内腔充分结合；
(4)将步骤(3)所得溶液的ph值用葡萄糖酸内酯调回至7.0，得到岩藻黄素-牡蛎肽复合物水溶液(岩藻黄素包埋率为91.5％)；
(5)将所述岩藻黄素-牡蛎肽复合物水溶液直接喷雾干燥，或经减压浓缩后冷冻干燥，得到岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒干粉。
考察该岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒干粉的物化性质与吸收效果，具体地：将其复溶于去离子水后，形成澄清透明的溶液，平均粒径为100nm，在660nm处的透光率为98％，在常温下储藏12个月不会出现絮凝或分层现象且岩藻黄素的保留率为95.7％，在常温下储藏24个月岩藻黄素的保留率为94.9％；将该岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒干粉溶于去离子水后(0.2μmol/ml)(处理组)，灌胃小鼠，以未与牡蛎肽结合的岩藻黄素作为对照(对照组)，4小时后，分析小鼠血浆中的岩藻黄素含量，与对照组相比(91.3pmol/ml)，处理组小鼠血浆中的岩藻黄素含量达到591.6pmol/ml，提高了5.48倍。
实施例4
(1)称取8.0g平均分子量为3000da的牡蛎肽，加入92ml去离子水，充分搅拌溶解，用氢氧化钠调节ph值至11，得到浓度为8.0wt％的碱性蛋白质溶液；
(2)称取0.48g的岩藻黄素粉末，加入144μl的0.1wt％氢氧化钠乙醇溶液充分溶解，然后加入1.12g的花生四烯酸，搅拌均匀，得到岩藻黄素浓度为30wt％的岩藻黄素分散液；
(3)将1.6g岩藻黄素分散液缓慢加入到步骤(1)所得的全部碱性蛋白质溶液中，搅拌均匀，超声处理2小时，使岩藻黄素与牡蛎肽疏水内腔充分结合；
(4)将步骤(3)所得溶液的ph值用葡萄糖酸内酯将混合溶液的ph值调回至7.0，得到岩藻黄素-牡蛎肽复合物水溶液(岩藻黄素包埋率为95.1％)；
(5)将所述岩藻黄素-牡蛎肽复合物水溶液直接喷雾干燥，或经减压浓缩后冷冻干燥，得到岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒干粉。
考察该岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒干粉的物化性质与吸收效果，具体地：将其复溶于去离子水后，形成澄清透明的溶液，平均粒径为97nm，在660nm处的透光率为98％，在常温下储藏12个月不会出现絮凝或分层现象且岩藻黄素的保留率为92.1％，在常温下储藏24个月岩藻黄素的保留率为94.6％；将该岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒干粉溶于去离子水后(0.2μmol/ml)(处理组)，灌胃小鼠，以未与牡蛎肽结合的岩藻黄素作为对照(对照组)，4小时后，分析小鼠血浆中的岩藻黄素含量，与对照组相比(91.3pmol/ml)，处理组小鼠血浆中的岩藻黄素含量达到546pmol/ml，提高了4.98倍。
实施例5
(1)称取8.0g平均分子量为3000da的牡蛎肽，加入92ml去离子水，充分搅拌溶解，用氢氧化钠调节ph值至11，得到浓度为8.0wt％的碱性蛋白质溶液；
(2)称取0.24g的岩藻黄素粉末，加入48μl的0.5wt％氢氧化钠乙醇溶液充分溶解，然后加入0.56g的二十二碳六烯酸，搅拌均匀，得到岩藻黄素浓度为30wt％的岩藻黄素分散液；
(3)将0.8g岩藻黄素分散液缓慢加入到步骤(1)所得的全部碱性蛋白质溶液中，搅拌均匀，超声处理0.5小时，使岩藻黄素与牡蛎肽疏水内腔充分结合；
(4)将步骤(3)所得溶液的ph值用葡萄糖酸内酯调回至7.0，得到岩藻黄素-牡蛎肽复合物水溶液(岩藻黄素包埋率为97％)；
(5)将所述岩藻黄素-牡蛎肽复合物水溶液直接喷雾干燥，或经减压浓缩后冷冻干燥，得到岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒干粉。
考察该岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒干粉的物化性质与吸收效果，具体地：将其复溶于去离子水后，形成澄清透明的溶液，平均粒径为100nm，在660nm处的透光率为98％，在常温下储藏12个月不会出现絮凝或分层现象且岩藻黄素的保留率为97.1％，在常温下储藏24个月岩藻黄素的保留率为96.2％；将该岩藻黄素-牡蛎肽纳米颗粒干粉溶于去离子水后(0.2μmol/ml)(处理组)，灌胃小鼠，以未与牡蛎肽结合的岩藻黄素作为对照(对照组)，4小时后，分析小鼠血浆中的岩藻黄素含量，与对照组相比(91.3pmol/ml)，处理组小鼠血浆中的岩藻黄素含量达到504pmol/ml，提高了4.52倍。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。