口部制剂的制作方法
【专利说明】口部制剂 发明领域
[0001] 本发明涉及口部组合物（oral composition)。本发明还涉及用于控制呼气臭味的 方法，所述方法包括：提供根据前述权利要求中任意一项的口部组合物；并且将所述组合 物施用到口腔（oral cavity)。本发明还提供了用于控制呼气臭味的口部组合物以及所述 口部组合物用于制造用于控制呼气臭味的药物的用途。本发明还提供了甲基硫醇氧化酶多 肽、编码此多肽的多核苷酸、包含此多核苷酸的核酸构建体和宿主细胞、生产甲基硫醇氧化 酶多肽的方法和包含此多肽的组合物。
[0002] 发明背景
[0003] 在大多数情况下（85-90% )，口气源自口（mouth)本身。白天口气的强度由于食 用某些食物（如大蒜、洋葱、肉、鱼和乳酪），肥胖，吸烟和饮酒而不同。由于口被暴露于较 少的氧并且在夜间不活动，臭味通常在睡醒时更重（"晨起口气"）。口气可能是短暂的，往 往在饮食、刷牙、使用牙线或用专门的漱口剂冲洗之后消失。口气也可能是持续的（慢性口 气），这是更严重的情况，以不同程度影响大约25%的人群。
[0004] 大多数报告现在同意口臭最常见（80-90% )的来源在于口腔中并且包括细菌储 积处（bacteria reservoirs)如舌面、唾液和牙周袋，其中厌氧细菌降解含硫氨基酸，产生 恶臭的挥发性硫化合物（volatile sulphur compounds，VSCs)。虽然有些人的确认为其他 臭味挥发物如某些胺和脂肪酸可能起作用，但这些VSCs是口腔恶臭的主要因素。
[0005] 大多数医生和牙医对慢性口臭并未很好地理解，所以一直不容易找到有效的治 疗。可能会建议以下策略：
[0006] (i)每日两次轻轻地清洁舌头表面是控制口气的最有效方法；这可以使用牙刷、 舌头清洁器或舌刷/舌刮来擦掉细菌生物层、残渣和粘液来实现。在舌头表面涂刷少量的 抗菌口腔清洗剂或舌头凝胶（tongue gel)将进一步抑制细菌活动。
[0007] (ii)进食有粗糙食物的健康早餐帮助清洁舌头的最后部。
[0008] (iii)由于口干可增加细菌的堆积，引起或加重口臭，咀嚼无糖口香糖可以帮助生 产唾液，从而有助于减少口气。当口干时或当不能在用餐（尤其是餐品富含蛋白质）之后 进行口腔卫生程序时，咀嚼可能尤其有用。这有助于提供唾液，唾液冲走口部细菌，具有抗 菌特性并促进帮助清洁口的机械活动。
[0009] (iv)虽然漱口剂可能含有被大多数牙膏中存在的皂剂失活的活性成分，但有时建 议睡前用有效漱口剂漱口。因此，避免在用牙膏刷牙后直接使用漱口剂（也见漱口剂，下 方）是推荐的。
[0010] (V)益生菌治疗，特别是Streptococcus salivarius K12已经显示抑制恶臭细菌 的生长。
[0011] 但是，还没有一个记载的医疗案例是用任何目前可用的漱口剂成功治愈慢性口臭 的。而且，漱口剂经常含有抗菌剂包括氯化十六烷吡啶、氯己定，其可引起牙齿的临时染色， 具有令人不快的味道，并且重要的是，可干扰有益口部细菌菌群的生长。漱口剂也可含有酒 精，酒精是干燥剂并可恶化慢性口气。
[0012] 应避免口部组合物例如漱口剂和口香糖的抗菌/杀菌活性，因为它们影响口部生 态系统。例如，含有氯己定的漱口剂将口部硝酸盐还原力削弱90%并由此削弱血浆亚硝 酸盐水平的水平25%，导致2-3. 5mm的血压升高（Kapil等人Free Radical Biology and Medicine 55(2013)93-100)。这是高度显著的，因为Cook 等人（Archives of Internal Medicine 155(7) (1995)701-9)估计年龄在35-64岁的白种美国受试者的人口平均舒张血 压的2mm Hg的降低将导致高血压患病率减少17%，中风风险减少15%以及冠心病风险减 少6% 〇
[0013] 虽然口气主要会带来尴尬或烦扰，然而最主要造成口臭的VSCs也会潜在损害口 中的组织，并且可以导致牙周炎（牙龈和支撑牙齿的韧带的炎症）。特别地，已发现VSCs通 过切割二硫键来破坏结缔组织中的胶原蛋白和蛋白聚糖组分。胞外基质的这种解聚集使得 微生物渗入口部粘膜。随着细菌进一步在牙齿附近形成的袋中积聚，牙周疾病以及口臭发 展。如果牙周疾病显著恶化，整体的系统健康可受到危害；例如，牙周细菌的副产物可以进 入血流并可导致心脏疾病、中风和婴儿出生体重过轻。
[0014] 很明显，口臭影响美容和健康。
[0015] 因此，需要可以用来控制口气并避免相关健康问题的改进的口部组合物。理想情 况下，这些组合物应当是口感中性，避免染色牙齿并且是非抗菌性的。 发明概要
[0016] 本发明涉及控制呼气臭味（breath-odour)，特别是控制挥发性硫化合物（VSCs) 的组合物。已经发现用口呼气的感官评分测量的口部内口臭的程度和口呼气中VSCs硫化 氢（H 2S)和甲基硫醇（CH3SH)的浓度之间的强相关性。
[0017] 根据本发明，由此提供了包含挥发性硫化合物呼气臭味控制量的甲基硫醇氧化酶 (MM-氧化酶）的口部组合物。然而，该酶尚未被克隆并且无序列信息可用；而且，所述酶仅 仅曾从细胞培养物中分离。已知的表达MMO-氧化酶的微生物种的培养物是不普通的，需要 使用非标准的培养基以及恶臭或有毒的基质。因此，目前没有可以用于本发明制剂的方便 的、节省成本的MMO-氧化酶来源。鉴于此，本文中描述了鉴定MMO-氧化酶的基因序列以及 它们在容易培养的微生物中表达的策略。
[0018] 该策略的使用促成了新的MM-氧化酶的鉴定。虽然几种硫细菌的基因组已经被测 序，它们之中没有一个包含本文所鉴定的MM-氧化酶基因序列（具有SEQ ID NO :2示出的 氨基酸，实施例中也被称为HDEA00816)。获得这种酶的序列使得其能用常规的酶表达技术 来生产，提供MM-氧化酶的方便的来源。
[0019] 因此，本发明提供了含有MM-氧化酶的组合物，所述组合物可以容易地以节省成 本的方式来生产。本发明的组合物中使用的MM-氧化酶可以是任何MM-氧化酶，例如本文 所描述的MM-氧化酶。
[0020] 因此，本发明提供了包含挥发性硫化合物呼气臭味控制量的甲基硫醇氧化酶的口 部组合物。酶组合物已知是非抗菌的/非杀菌的（有一些公知的例外，例如氯过氧化物酶 和乳过氧化物酶）。因此，本发明的MM-氧化酶组合物是有利的，因为它们不会干扰口部菌 群。此外，这样的组合物是无味的，不像例如被提出用于口部组合物并且具有很强的芥末味 的异硫氰酸烯丙酯。
[0021] 本发明另外提供了具有甲基硫醇氧化酶活性的多肽，其中所述多肽是：
[0022] (a)包含SEQ ID NO :2示出的氨基酸序列的多肽；
[0023] (b)包含与SEQ ID NO :2的氨基酸序列有至少50%的序列同一性的氨基酸序列的 多肽；
[0024] (c)由包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3示出的多核苷酸序列的多核苷酸编码的 多肽；或
[0025] (d) (a)、（b)、（c)或（d)定义的多肽的片段。
[0026] 这样的多肽可以用于本发明的口部组合物。
[0027] 本发明还提供了：
[0028] -编码本发明的多肽的多核苷酸；
[0029] -包含本发明的多核苷酸的核酸构建体；
[0030] -包含本发明的多核苷酸或核酸构建体的宿主细胞；
[0031] -生产本发明的多肽的方法，其包括：
[0032] (a)在有益于由所述宿主细胞（host cell)生产所述多肽的条件下培养本发明的 宿主细胞；以及，任选地
[0033] (b)回收所述多肽；
[0034] -组合物，例如口部组合物，包含本发明的多肽和至少一种另外的成分；
[0035] -用于控制对象（host)中呼气臭味的方法，所述方法包括：
[0036] 提供本发明的组合物，例如包含本发明的多肽的组合物；并且
[0037] 将所述组合物施用到对象的口腔中；
[0038] -用于控制呼气臭味的本发明的口部组合物；以及
[0039] -本发明的口部组合物用于制备用于控制呼气臭味的药物的用途；
[0040] 附图描沐
[0041] 图1示出了通过DEAE和羟基磷灰石层析纯化的DMSO生长的Hyphomicrobium EG 细胞的裂解物的SDS-PAGE。泳道1 :分子量标记；泳道2 :DEAE层析后的细胞提取物；泳道 3和4 :羟基磷灰石柱的流过物（flow-through);泳道5、6和7 :从羟基磷灰石柱洗脱的第 一蛋白峰的峰级分；泳道8、9和10 :从羟基磷灰石柱洗脱的第二蛋白峰的峰级分。
[0042] 图2示出了多种E. coli克隆MM01( '101'）、MM02( '102'，三个不同的转化体）、 MM03( '103)和MM04( '104)的裂解物中存在的乙基硫醇氧化酶活性。'参照（Ref)'是指 来自没有Hyphomicrobium基因插入物的转化体的E. coli裂解物。酶活力单位单位= 在30°C下每分钟转化1微摩尔乙基硫醇。
[0043] 图3示出了如顶空分析（headspace analysis)测试的通过与Zendium牙膏混合 的不同羟基磷灰石酶级分的甲基硫醇随着时间的降解。
[0044] 序列表描沐
[0045] SEQ ID NO :1示出了名为MM02的开放阅读框的核苷酸序列。
[0046] SEQ ID N0:2示出了 HDEA00816蛋白（MM02)的氨基酸序列，其没有推定的信号肽 MAFSLGVTPSSAo
[0047] SEQ ID NO :3示出了 5'端引入NdeI位点和3'端引入终止密码子和AscI和 HindIII位点的E. coli优化的MM02基因（命名MM02E)的核苷酸序列。
【发明内容】
[0048]
[0049] 在本申请的整个说明书和所附权利要求书中，词语"包括"、"包含"和"具有"及其 变化形式应被解释为包含性的。也就是说，在上下文允许时，这些词语旨在传达可能包括未 明确指出的其他要素或整体数。
[0050] 在本文中没有数量词修饰时用于表示一或多于一（即一或至少一）的客体。例如， "元件"可表示一个/种元件或多于一个/种元件。
[0051] 本发明涉及控制呼气臭味的口部组合物。也就是说，本发明的口部组合物旨在减 少可造成呼气臭味的一种或更多种挥发性硫化合物（VSCs)的量。因此，在本发明的上下文 中，挥发性硫化合物呼气臭味控制量的甲基硫醇氧化酶是减少一种或更多种VSCs的存在 使得呼气臭味减少（例如如化学测定或感官测定的）的量。
[0052] 本文中，术语呼气臭味（breath-odour)、口臭（halitosis)、恶臭（malodour)等都 旨在表示存在臭味的VSCs。
[0053] 术语"口部恶臭（oral malodour)"已被使用在文献中来指源自口的口气。然而， Tangerman 和 Winkel (J Clin. Perodontol. 34, 748-755, 2007)区分使用了术语"口 内口臭 (intra-oral halitosis)"而非口部恶臭，以便将其与口外口臭（extra-oral halitosis) 区分。口内口臭和口外口臭之间的区分可以通过比较口呼气与鼻呼气来进行。
[0054] Tangerman和Winkel认为，在口部口臭中，相比H2S，口呼气中的VSC甲基硫醇 MM(CH3SH)的存在是口部恶臭的更主要致病因素。
[0055] 本发明的组合物包含甲基硫醇氧化酶（MM-氧化酶）。MM-氧化酶是具有能够氧化 甲基硫醇的活性的任何酶。也就是说，MM-氧化酶（EC1. 8. 3. 4)是催化下述化学反应的任 何酶：
[0056] 甲硫醇+O2+H2O #甲酸+硫化氢1+H2O2
[0057] 该酶的3个底物是甲硫醇（甲基硫醇）、02和H 20,而其3个产物是甲醛、硫化氢和 H2O2。
[0058] 所述酶属于氧化还原酶家族，特别是以氧作为受体作用在供体的硫基团的那些。 该酶类别的系统名称是甲硫醇：氧氧化还原酶。适合用于本发明的酶可以被称作甲硫醇 氧化酶、甲基硫醇（methylmercaptan)氧化酶、甲基硫醇（methyl mercaptan)氧化酶、 (MM)-氧化酶或MT-氧化酶。
[0059] 适合用于本发明的MM-氧化酶可以是来自任何来源的任何MM-氧化酶。本发 明的口部组合物可以包含源自或可源自Hyphomicrobium种特别是Hyphomicrobium EG、 Rhodococcus 种例如 Rhodococcus rhodochrous 或 Thiobacillus 种例如 Thiobacillus thioparus的甲基硫醇氧化酶。
[0060] 术语"源自"在本文中也包括术语"由......起源"、"由......获得"、 "由......能够获得"、"由......分离"和"由......产生"并且一般表示一个特定的材 料由另一个特定的材料起源或者具有可以参照另一个特定的材料来描述的特征。如本文所 用，"源自"微生物的物质（例如核酸分子或多肽）优选地是指所述物质对该微生物而言是 本源的（native)。
[0061] 由任何上述微生物物种传统生产MM氧化酶经济上是不可行的。尤其是因为相关 基质的毒性或不良气味，以及因为这样的生物体在最大化所期望的MM-氧化酶活性的生产 所需的基质上的非常低的生长率。因此，通常需要通过重组DNA技术过表达所述酶来为本 发明的口部组合物提供MM-氧化酶。
[0062] 本文描述了可以通过重组手段来表达的MM-氧化酶。当涉及细胞、核酸、蛋白质或 载体时，术语"重组"表示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或改 变天然核酸或蛋白质而被修饰，或所述细胞是源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞 表达在天然（非重组）形式的细胞中没有发现的基因或表达否则异常表达、低表达或根本 不表达的天然基因。术语"重组"与"遗传修饰"是同义的。
[0063] 因此，本发明提供了具有MM-氧化酶活性的多肽。这样的多肽可以选自由以下组 成的组：
[0064] (a)包含SEQ ID NO :2示出的氨基酸序列的多肽；
[0065] (b)包含与SEQ ID NO :2的氨基酸序列有至少50%的序列同一性的氨基酸序列的 多肽；
[0066] (c)由包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3示出的多核苷酸序列的多核苷酸编码的 多肽；或
[0067] (d) (a)、（b)或（c)定义的多肽的片段。
[0068] 这样的多肽可以包含与SEQ ID NO :2有至少60%序列同一性、优选至少约70%、 更优选至少约80%、更优选至少约85%、甚至更优选至少约90%、甚至更优选至少约93%、 甚至更优选至少约95%、甚至更优选至少约96%、优选至少约97%、甚至更优选至少约 98%并且甚至最优选至少约99%的序列同一性的氨基酸序列。
[0069] 也就是说，本发明涉及包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的多肽并涉及其变体（如 上所示与SEQ ID NO :2具有序列同一性）。如本文所用，术语"变体"、"衍生物"、"突变体"或 "同源物"可以互换使用。它们可以指多肽（或指核酸等。变体相对于包含SEQ ID NO :2的 氨基酸序列的多肽在一个或更多个位置包含替换、插入、缺失、截短、颠换（transversion) 和/或倒位（inversion)。变体可以例如通过位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、随机诱 变、定位诱变和定向进化以及多种其他重组方法来制备。变体多肽可以有少数氨基酸残基 不同于参考多肽，并且可以通过一级氨基酸序列与参考多肽的同源性/同一性的水平来定 义。
[0070] 优选地，变体多肽与包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的多肽具有至少50%、至少 60%、至少70% 70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至 少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或甚至至少99 %的氨基酸序 列同一性。
[0071] 本发明的变体可以是包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的多肽的等位变体。"多肽 的等位变体"在此定义为由基因的等位变体编码的多肽。术语"基因的等位变体"在本文中 是指占据相同染色体基因座的基因的两个或更多个替代形式的任意种。基因的等位变体可 以包括沉默的（导致由该基因编码的多肽的氨基酸序列没有变化）基因突变；其可以包括 导致具有改变的氨基酸序列的多肽的基因突变，或者其可以两者均包括。
[0072] 用于测定同一性百分比的方法是本领域已知的并在本文中被描述。一般地，变体 保留了参考多肽的特征性质，但在一些特定方面具有改变的特性。例如，变体可具有改变 的最佳PH、改变的底物结合能力、改变的对酶促降解或其他降解的抗性、增加的或降低的活 性、改变的温度稳定性或氧化稳定性，但保留其特征性功能。变体还包括具有化学修饰的多 肽，所述化学修饰更改参考多肽的特征。
[0073] 对于核酸，术语"变体"可以指编码变体多肽的核酸，其与包含SEQ ID NO :1或3 示出的核酸序列的多核苷酸具有特定程度的同源性/同一性。优选地，变体多核苷酸与包 含SEQ ID NO :1或3示出的核酸序列的多核苷酸具有至少50%、至少60%、至少70%、至 少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少 95%、至少96%、至少97%、至少98 %或甚至至少99%的核酸序列同一