. bayanus、S. pastorianus、S. carlsbergensis)， Kluy veromyces，Candi da(例如 C. revkaufi、C. pul cherrima、C. tropical is、C. uti I is)， Pichia (例如 R pas tor is)，Schizosaccharomyces，Hansenula，Kloeckera，Schwanniomyces 以及 Yarrowia (例如 Y. Iipolytica (之前被归类为 Candida lipolytica))。
[0109] 原核宿主细胞可以是细菌宿主细胞。细菌宿主细胞可以是革兰氏阴性或革兰 氏阳性细菌。细菌的实例包括但不限于属于以下属的细菌：Bacillus (例如Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacillus circulans、 Bacillus clausii> Bacillus coagulans> Bacillus firmus> B. halodurans> Bacillus lautus、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus puntis、Bacillus pumilus、Bacillus stearothermophilus、Bacillus subtilis 或 Bacillus thuringiensis)，Acinetobacter，Nocardia，Xanthobacter，Escherichia(例 如 E. coli (例如 DH10B、Stbl2、DH5-alpha、DB3、DB3. I 菌株），DB4, DB5, JDP682 和 ccdA-over (例如美国申请号 09/518, 188))，T0P10F'，T0P10, DH10B，DH5a，HB101，W3110， BL21 (DE3)，BL21 (DE3) pLysS 和 Escherichia coli K-12 菌株，例如 DH1，HB101，RV308, RR1， W3110，C600) · Streptomyces (例如 Streptomyces Iividans 或 Streptomyces murinus) Erwinia，Klebsiella，Serratia (例如 S. marcessans)，Pseudomonas (例如 P. aeruginosa)， Salmonella(例如S. typhimurium、S. typhi)。细菌还包括但不限于光合细菌（例如绿色非 硫细菌（例如 Chorof Iexus 细菌（例如 C. aurantiacus)，Chloronema (例如 C. gigateum))， 绿色硫细菌（例如 Chlorobium bacteria(例如 C. limicola)，Pelodictyon(例如 P. Iuteolum)，紫色硫细菌（例如Chromatium(例如C.okenii))以及紫色非硫细菌（例如 Rhodospirillum(例如 R. rubrum)，Rhodobacter (例如 R. sphaeroides，R. capsulatus)以 及 Rhodomicrobium 细菌（例如 R. vanellii)) 〇
[0110] 宿主细胞可以是来自非微生物有机体的宿主细胞。这样的细胞的实例包括但不限 于昆虫细胞（例如 Drosophila(例如 D. melanogaster)，Spodoptera(例如 S. frugiperda Sf9或Sf21细胞）和Trichoplusa(例如，High-Five细胞）；线虫细胞（例如C. elegans 细胞）；禽类细胞；两栖动物细胞（如Xenopus Iaevis细胞）；爬行动物细胞；和哺乳动物 细胞（例如 NIH3T3、293、CHO、COS、VERO、C127、BHK、Per-C6、Bowes 黑素瘤和 HeLa 细胞）。
[0111] 本发明进一步提供了生产本发明多肽的方法，包括：
[0112] (a)在有益于由宿主细胞生产所述多肽的条件下培养本发明的宿主细胞；以及， 任选地
[0113] (b)回收所述多肽。
[0114] 因此，本发明的多肽的过表达可以通过本领域公知的的方法来完成。适合用于本 发明多肽的表达的原核细胞和真核细胞如上所述。
[0115] 使用被选择的启动子以及与被设计表达的宿主细胞相容的其他表达调节信号来 建立所需要的优选的宿主细胞中的过表达。在一个优选实施方案中，启动子序列可以由细 菌来源，例如如上所述的Bacillus菌株或Escherichia菌株获得。
[0116] 合适的启动子位点的实例包括Bacillus Ientus碱性蛋白酶基因（aprH)的启 动子、Bacillus Iicheniformis碱性蛋白酶基因（枯草杆菌蛋白酶Carlsberg基因）的 启动子、Bacillus subtilis果聚糖鹿糖酶基因（sacB)的启动子、Bacillus subtilis α_淀粉酶基因（amyF)的启动子、Bacillus Iicheniformis α-淀粉酶基因（amyL)的 启动子、Bacillus stearothermophilus产麦芽糖淀粉酶基因（amyM)的启动子、Bacillus amyloliquefaciens α-淀粉酶基因（amyQ)的启动子。还有另一个实例是"_35"区域具 有TTGACA序列和"-10"区域具有TATAAT序列的"共有（consensus) "启动子。以及另外 地，Bacillus Iicheniformis 青霉素酶基因（penP)启动子和 Bacillus subtilis xylA 和 xyIB基因的启动子。
[0117] 或者，E. coli可以用作宿主细胞。合适的载体是常常用于克隆和表达的载体并且 本领域技术人员已知的载体，例如 cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq、 T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、1-PR或I-PL启动子。用于E. coli的表达的合适载体的实 例例如在 Makrides，S.C.，Microbiological Reviews，Vol. 60，No. 3，（1996)，512-538 的 表1中给出。优选地，所述载体含有克隆位点上游的启动子，所述克隆位点含有编码MM-氧 化酶的核酸序列，其可以在宿主已经被培养表达具有MM-氧化酶活性的相应多肽之后开 启。可被开启和关闭的启动子是本领域技术人员已知的并且例如是Iac启动子、araBAD启 动子、17启动子、trc启动子、tac启动子和trp启动子。在本发明的框架内特别有用的 例如是W000/66751描述的载体，例如没有插入的青霉素 G酰化酶基因的pKAFssECtrp或 pKAFssECaro。
[0118] 所述载体的选择有时可取决于宿主的选择，反之亦然。如果例如使用具有araBAD 启动子的载体，无法分解阿拉伯糖诱导物（ara_)的E. coli宿主菌株是强烈优选的。
[0119] 编码MM-氧化酶的核酸序列可以整合到宿主细胞的基因组中，其常常不含有本发 明的核酸序列并且被（过）表达。这可以根据本领域技术人员已知的方法来完成。
[0120] 本发明的MM-氧化酶的表达可以通过培养如本文所述的宿主细胞来进行。发酵 后，可以通过离心或过滤收获宿主细胞。然后通过公知的方法将细胞重悬浮和裂解，例如用 溶菌酶孵育或使用法式压滤（French presss)。如果宿主细胞使用E.coli，所述细胞可以 优选地通过冷冻细胞然后用溶菌酶处理来裂解。
[0121] 裂解的细胞物质然后再次过滤或离心来获得溶解于滤液或上清液的MM-氧化酶。 如果需要的话，可以通过任何合适的色谱法例如关于MM-氧化酶的现有科学文献中描述的 选择沉淀或色谱法对MM-氧化酶进行纯化。
[0122] 因此，本发明涉及组合物，例如口部组合物，其包含本发明的多肽和至少一种另外 的成分。
[0123] 本发明的口部组合物（其包含任何MM-氧化酶，例如本发明的多肽）可以是使得 其可以被施用到口腔的任何合适的形式。通常，本发明的口部组合物可以是液体或固体组 合物。
[0124] 如本文所用的术语"液体制剂"是指制剂，即根据配方的两种或更多种组分的混合 物，其在大气压下在至少约2°C或更高的温度下是液体。所述液体制剂可以含有水或有机液 体或它们的混合物。有机液体在此被定义为有机物质或两种或更多种有机物质的混合物， 所述有机物质在大气压下在至少2°C或更高的温度下是液体。有机物质是由含有碳的分子 制成的。所述液体制剂可以通过加入一种或更多种稳定剂来稳定以产生稳定的液体制剂。 稳定的液体制剂是，在特定条件下储存时，其中包含的活性成分实质上保留了它们的化学、 物理和/或生物活性的液体制剂。例如，稳定的液体制剂在冷藏温度（2-8°C)下可以稳定 至少12个月，优选地2年，更优选地3年；或者在室温（23-27°C )下可以稳定至少3个月， 优选地6个月，并且更优选地1年。
[0125] 术语"固体制剂"是指下述制剂，即根据配方的两种或更多种组分的混合物，其为 固体状态而不是液体或气体。所述固体制剂在l〇〇°C或更低的温度下优选是固体状态。液 体、分散液（dispersions)和溶液不属于该词的含义范围。此外，半固体例如凝胶、软膏、膏 剂和霜剂也不属于该词的含义范围。所涵盖的固体制剂的代表性实例包括胶囊、片剂、丸 剂、颗粒和粉剂。
[0126] 其中可掺入MM-氧化酶例如本发明的多肽来提供具有控制呼气臭味的能力的组 合物的本发明的固体口部组合物包括例如口香糖（例如压缩的口香糖），糖果（例如硬糖 (hard boiled candy)、慢煮糖（low boiled candy)和阻嚼糖（chewy candies))，宠物阻嚼 物或饼干，牛乳糖（nougats)，巧克力，太妃糖，糖衣丸（dragees)，焦糖，锭剂（lozenges)， 润喉糖（throat drop)，压制片诸如压制薄荷糖（pressed mint)，胶囊，可食性膜，坚果，泡 沫剂，洁齿剂例如牙膏、牙粉和它们的组合。
[0127] 本发明的液体组合物可以是漱口水（mouthrinse) /漱口剂（mouthwash)或口喷雾 例如或糖浆。
[0128] 口香糖是任何类型的胶状物，所述胶状物例如由糖胶树胶，一种天然胶乳产物，或 例如已知为聚异丁烯的合成橡胶制成。
[0129] 牙膏是膏剂或凝胶状洁齿剂，通常与作为配件的牙刷一起使用以清洁和维护牙齿 美观和健康。
[0130] 漱口剂或漱口水是任何用来增强口部卫生的液体产品，其通常通过漱口然后吐出 而使用。
[0131] 一般而言，本发明的口部组合物可以通过本领域的普通技术人员已知的任何手段 或方法来制备。然而，口部组合物通常通过以下方法制备，所述方法包括将MM-氧化酶与口 部组合物的一种或更多种组分接触来形成混合物。
[0132] 例如，所述方法通常包括将所述酶例如以包封的形式放置在含有口部组合物的一 种或更多种组分的容器中，或者除包封的酶外已完成的口部组合物（即包封的酶最后加 入）。一般地，所述方法还包括将组分的混合物形成用于口部消耗的合适的形状。
[0133] 虽然MM-氧化酶能够氧化存在的甲烷硫醇的氧化中形成的H2S(如原文所述），所 述酶也可以与已知结合H 2S的化学物质例如锌盐，特别是有机锌盐组合。适合以该方式使 用的有机锌盐包括抗坏血酸锌、乙酸氢锌、乳酸锌、柠檬酸锌、葡萄糖酸锌和它们的组合。
[0134] 此外，可以配制组合物来增加口中的停留时间。例如，W02007/143989公开了包含 疏水酶制剂的口香糖，所述疏水酶制剂减少酶从口香糖的释放使得酶在口中的停留时间增 加。
[0135] 也可配制组合物来含有下述化合物，所述化合物调节口的pH至对MM-氧化酶最佳 的pH。
[0136] 口部组合物可以是包含MM-氧化酶的洁齿剂的形式。含酶的洁齿剂组合物是本领 域技术人员公知的。例如US4, 150, 113和美国专利号4, 178, 362分别公开了酶性牙膏和含 有葡萄糖氧化酶的酶性可咀嚼洁齿剂。另一些含酶的洁齿剂被公开在例如US 4, 537, 764、 U. S. 4, 578, 365、US 4, 564, 519、US 5, 176, 899、US 4, 564, 519 和 US 4, 578, 265 中。这些文 件详细描述了酶至洁齿剂例如牙膏的配制，并可以应用于MM-氧化酶至洁齿剂组合物的配 制。
[0137] 本发明的口部组合物可以是口香糖的形式，所述口香糖可包含：
[0138] 不溶于水的基质；
[0139] 水溶性部分；
[0140] 挥发性硫化合物呼气臭味控制量的甲基硫醇氧化酶；以及任选地甜味剂和/或调 味剂。
[0141] 这样的口香糖中的MM-氧化酶可以包含在多种不同的口香糖组合物中。所述 口香糖可以是许多不同的结构。例如，口香糖可以是单件，例如棒、板或其他单元性结构 (unitary structure)〇
[0142] 另一方面，口香糖可以包含外包衣（over-coated)制剂。
[0143] 在这方面，如果期望，MM-氧化酶可以位于基本上包裹胶质中心的包衣内或壳内。 在一个实施方案中，所述包衣可以包含约40 %至约75 %的口香糖组合物。除了 MM-氧化酶， 所述包衣可以包括掩蔽剂来改进含有MM-氧化酶的包衣的味道。
[0144] 多种掩蔽剂均可使用，包括：三氯蔗糖、葡萄糖酸锌、乙基麦芽酚、甘氨酸、安赛 蜜_k、阿斯巴甜、糖精、果糖、木糖醇、喷雾干燥的甘草根、甘草甜素、葡萄糖、葡糖酸钠、葡糖 酸-S-内酯、乙基香草醛、香草醛、普通和高强度甜味剂以及多种适当的调味剂。可以使用 足量的掩蔽剂来掩盖MM-氧化酶酶制剂的味道。如期望，可以使用多于一种掩蔽剂。
[0145] 可以使用多种方法制作包衣的口香糖。例如，所述包衣可以以三阶段操作被应用 至口香糖中心。
[0146] 在第一阶段，交替施用的糖浆和粉末的粗包衣被施用到中心。这之后是称为磨光 包衣（finishing coating)的第二阶段，其中使用细粉和较长的滚光（tumbling)来产生光 滑的磨光。最后，进行以虫胶处理和抛光的第三阶段，从而提供光泽度高的光滑磨光。如期 望，可以省去第二阶段和第三阶段。包衣可以围绕如下所述的多种不同类型的胶质中心组 合物。
[0147] 在本发明的另一个实施方案中，可压缩的赋形剂被制成片剂然后用包含MM-氧化 酶的口香糖产物包被。通过举例的方式但非限制，所述制成片剂的赋形剂可以包括葡萄糖、 蔗糖或其他糖类，山梨糖醇，甘露糖醇，异麦芽糖醇，其他可压缩的糖醇或它们的组合。所述 制成片剂的可压缩的赋形剂基本上由胶的包衣包围。所述包衣包含MM-氧化酶，并且在一 个实施方案中，包含至少50重量％的产物。此外，所述涂层可以包含掩蔽剂和口香糖。
[0148] 现在涉及本发明的口香糖，口香糖可以优选是低水分的，含糖的或无糖的，含蜡的 或无蜡的，低热量的（通过高基（high base)或低热量增量剂）和/或可含有其他牙科剂 和/或药剂。
[0149] 一般地，口香糖通常包括水溶性增量部分、不溶于水的可咀嚼胶质基质部分以及 任选地调味剂和/或甜味剂。在咀嚼过程中水溶性部分随着调味剂经时间消散。所述胶质 基质部分在整个咀嚼过程中保留在口中。术语口香糖指一般意义上的口香糖和泡泡糖。
[0150] 不溶性胶质基质通常包括弹性体、树脂、脂肪和油、软化剂和无机填料。胶质基质 可以包含或不包含蜡。不溶性胶质基质可以构成口香糖的约5重量％至约95重量％，更常 见地，胶质基质构成10重量％至约50重量％的胶，并且在一些优选的实施方案中，约15重 量％至约35重量％的口香糖。
[0151] 本发明的口香糖胶质基质可以含有约20重量％至约60重量％的合成弹性体，约 0重量％至约30重量％的天然弹性体，约5重量％至约55重量％的弹性体增塑剂，约4重 量％至约35重量％的填料，约5重量％至约35重量％的软化剂以及任选的少量（约1重 量％或更少）的杂项成分例如着色剂、抗氧化剂等。
[0152] 弹性体提供胶的弹性、粘性，其根据成分的化学结构以及其与其他成分如何复合 而不同。合成的弹性体可以包括但不限于聚异丁烯、异丁烯-异戊二烯共聚物（丁基橡胶）、 苯乙烯-丁二烯、具有约I : 3至约3 : 1比例的苯乙烯-丁二烯的共聚物、聚乙酸乙烯酯、 具有共聚物的约5重量％至约50重量％的月桂酸乙烯酯含量的乙酸乙烯酯月桂酸乙烯酯 共聚物，以及它们的组合。
[0153] 天然弹性体可以包括天然橡胶，例如烟熏乳胶或液体乳胶和银胶菊，以及天 然胶例如节路顿胶（ielutong)、乐驰卡斯皮胶（lechi caspi)、紫苏胶（perillo)、索 马胶（sorva)、二齿铁线子胶（massaranduba balata)、巧克力铁线子（massaranduba chocolate)、佩罗胶（nispero)、rosindinha、糖胶树胶（chicle)、古塔胶（gutta hang kang)以及它们的组合。优选的合成弹性体和天然弹性体浓度根据其中使用了基质的口香 糖是粘性的或常规的，泡泡胶或常规胶与否而不同。优选的天然弹性体包括节路顿胶、糖胶 树胶、索马胶和二齿铁线子胶。
[0154] 弹性体增塑剂可以包括但不限于，松香酯例如松香的甘油醋、松香的甲基醋、松香 的季戊四醇酯；由α -蒎烯，β -蒎烯和/或d-柠檬烯衍生的萜烯树脂；以及前述的任何合 适的组合。所述树脂增粘剂调节最终胶的粘结性（cohesiveness)和粘性（tackiness)。优 选的弹性体增