br>[0034] 按照另一个实施方案,提供本文公开的类囊体的组合物用于作为益生元试剂的非 治疗性应用。由于本文公开的类囊体的组合物可以改变胃肠微生物群的组成和/或活性, 因此其可以对宿主舒适和健康赋予益处。
[0035] 另一个实施方案涉及治疗或预防哺乳动物中与紊乱的肠道微生物群相关的病症 的方法。在这样的方法中,对患有与紊乱的肠道微生物群相关的病症的哺乳动物口服施用 有效量的本文公开的组合物。此外,所述方法还包括对哺乳动物口服施用本文公开的组合 物,以防止所述组合物发展紊乱的肠道微生物群。与紊乱的肠道微生物群相关的病症的实 例包括抗生素相关的腹泻、旅行者腹泻、小儿腹泻和肠易激综合征。
[0036] 当用于本文时,"防止/预防"不应该解释为意指,为获得预防在使用本文公开的 实施方案所述的组合物后病症和/或疾病可能永远不再发生。此外,该术语不应该解释为 意指,在所述预防所述病症的应用之后,病症至少在某种程度上不可能发生。相反,"防止/ 预防"意欲意指,要预防的病症,如果尽管在所述应用的存在下仍然发生,与没有所述应用 相比,严重性较小。按照一个实施方案,"防止/预防"涉及预防性处理。
[0037] 另一个实施方案涉及本文公开的组合物用于施用到哺乳动物(如人)的肠中,以 增加胰岛素敏感性。为了治疗或预防2型糖尿病(非胰岛素依赖性糖尿病),可以增加胰岛 素敏感性。
[0038] 通常存在于人胃肠道中的益生细菌(统称为肠道微生物群)在营养获取和能量调 节方面具有重要的作用。今年来,已经提议在体重正常的人与超重或肥胖的人之间所述微 生物群是不同的。人和动物研宄的多种发现已经揭示肠道细菌的两个主要的门(即,革兰 氏阳性厚壁菌门(Firmicutes)和革兰氏阴性拟杆菌门(Bacteroidetes))的量通过改变宿 主能量获取效率而与肥胖症的病理生理学紧密相关。因此,在肥胖的动物和患者中,已经证 明了肠道中厚壁菌门的增加和拟杆菌门的减少。当肥胖患者以低卡路里饮食减轻体重时, 发生这些特殊细菌的比例的相反的改变。另一方面,关于胖人中肠道微生物群的这种变化 的证据是矛盾的。关于厚壁菌门和拟杆菌门,发现在肥胖和非肥胖个体之间没有区别,尽管 在胖人中,与正常体重的人相比,已经记录了拟杆菌门的显著的丰富性。这些发现提出肠道 微生物群在调节体重中起重要作用并且可能是发生肥胖的因素的可能性。
[0039] 其他的代谢疾病,如糖尿病,现在也证明与微生物群的组成改变有关。已经提议不 良调节的肠屏障,渗漏的肠道,可能导致胰岛素耐受性,并且最终导致糖尿病的发生。因此, 加强肠屏障将成为预防并且可能还治疗糖尿病和预防肥胖的新的治疗方法。
[0040] 摄入称为益生元的低血糖食物(low-glyceamic foods),如纤维,通过减缓碳水化 合物的肠道消化而增强饱食感是被充分接受的。益生元是对微生物群具有有益作用的非细 菌产品。它们作用为结肠微生物群的肥料,由此增加细菌共生生物体(如双歧杆菌属和乳 杆菌属)的生长。然而,来自延长的碳水化合物的消化的饱食感信号显然是不充足的。
[0041] 现在,世界上超过十亿成年人是超重的,其具有25-30kg/m2的体重指数(BMI),并 且超过三亿人是肥胖的,BMI > 30kg/m2。并且,超重和肥胖与高血脂(hyperlipidemia)、动 脉粥样硬化(atherosclerosis)和心血管病强烈相关。
[0042] 现在,在西方社会中我们有增加的美味食品(即,富含脂肪和蔗糖的食品)的可获 得性。这可能促进较过去的几十年间所观察到的体重的整体增加。为了帮助患有超重和肥 胖的个体,因此,找到加强饱食感信号并且抑制饥饿信号。我们已经发现,在向食品中饮食 补充了来自绿色叶子的类囊体膜后,影响了一些食欲激素,如饥饿激素(ghrelin)和胆囊 收缩素(cholecystokinin,CCK)(未公布的数据)以及胰岛素和瘦素。
[0043] 没有进一步详细解释,相信利用前述描述,本领域技术人员可以以其最充分的程 度应用本发明。因此,下述优选的具体的实施方案应该解释为仅是举例说明性的,并不以任 何方式限制本公开内容的其余部分。
[0044] 尽管已经参考一个或多个具体的实施方案描述了本发明,但是其不意欲局限为本 文所述的具体形式。相反,本发明仅由附上的权利要求限制,并且,除了上述具体的实施方 案之外的实施方案同等可能的存在于这些附上的权利要求的范围之内,例如,不同于上文 所述的那些的实施方案。
[0045] 在权利要求书中,术语"包括/包含"不排除存在其他元件或步骤。另外,尽管不 同的权利要求可能包含个体特征,但是这些可以有利地组合,并且包含在不同的权利要求 中不暗示特征的组合是不可行的和/或不利的。
[0046]另外,单数引用不排除复数。术语"一个"、"第一"、"第二"等不排除复数。
[0047] 实验
[0048] 下述实验工作的目的是研宄类囊体对健康大鼠中的肠道微生物群的影响,及其对 血液胰岛素的作用。通过培养和独立于培养的技术来分析微生物群的组成。基于其代谢需 要的特定细菌的存活计数作为培养技术,并且定量PCR(q-PCR)、末端限制性片段长度多态 性(T-RFLP)和16S rDNA测序作为独立于培养的技术。
[0049] 然而,下述实施例仅是实施例,不应该以任何方式解释为限制本发明的范围。相 反,本发明仅由附上的权利要求所限制。
[0050]动物和实骀步驟
[0051] 在 Sprague-Dawley 品系(Mol :SPRD Han ;Taconic M&B A/S,Ry,丹麦)大鼠(褐 家鼠(Rattus norvegicus))上进行该研宄,大鼠在具有可控环境(20°C ±1°C,50% ±10% 相对湿度,12 :12-小时光暗循环)的特定的无病原体的条件下并用开放的笼系统养育。适 应7天后,将总共16只大鼠单独保持,并且喂饲对照饮食(8只大鼠)或富含类囊体的饮食 (8只大鼠)10天。
[0052] 类囊体膜从新鲜的幼菠菜叶提取并纯化,如前所述(Emek,SC,Szilagyi A, Akerlund H E,等? (2010)A large scale method for preparation of plant thyIakoids for use in body weight regulation(用于制备用于体重调节的植物类囊体的大 规模方法)Prepar biochem&biotech 40(1),13-27 ;Montelius C,Gustafsson K, Westrom B,等?(2011)Thylakoids reduce glucose uptake and decrease intestinal macromolecular permeability(类囊体减少葡萄糖摄入并减少肠大分子通透性).Br J Nutr 106 (6),836-44)。
[0053] 标准大鼠食物(R 36,Lantmiinnen,Stockholm,瑞典)仅用油菜籽油加富(对照 饮食),或用类囊体-油混悬液加富(类囊体饮食)。通过使用Ultraturrax混合器混合4g 类囊体粉末(对应132mg叶绿素)、5g油菜籽油和IOg水而制备类囊体饮食。通过每克正 常食品摄入物(22g食物/大鼠/天)加入6ng叶绿素,计算补充的类囊体的量。两种饮食 是等热量的,并且具有25E%碳水化合物、60E%脂肪和15E%蛋白的能量(E)分布。
[0054] 在10天的实验时间内每天记录体重。在早上,每只大鼠给予25g正常的大鼠食物 供其在一天内自由食用。在接下来的下午,取走剩余的大鼠食物,并且测量食用的量。然后, 每只大鼠给予15g实验饮食。在第11天,在进行葡萄糖耐量测试之前,在早上,在不含特定 病原体的条件下收集粪便样品。
[0055] 作为大剂量(bolus-dose)给予体积为其体重的10 %的15 %的葡萄糖溶液。通 过在O,15,30,45,60,90和120min的时间点扎刺尾部而测量血浆葡萄糖的浓度,而仅在 120分钟后测量胰岛素。然后,在进行剖腹之前,将大鼠用异氟烧(Schering-Plogh a/s, Ballerup,丹麦)麻醉。收集来自回肠、盲肠和结肠的肠黏膜样品,并且立即放置在含有3ml 冷冻介质的无菌管中。该研宄得到兰德大学动物实验伦理审查委员会的核准,并且按照欧 洲学会关于实验动物的保护规章进行。
[0056]细菌计数分析
[0057] 对于来自回肠、盲肠和结肠以及来自粪便样品的肠黏膜样品中的乳杆菌属、双歧 杆菌属和肠杆菌科(Enterobactericeae)的存活计数,使用常规的稀释方法。将来自适当 的稀释液的样品涂抹在Rogosa琼脂、改性的Wilkins-Chalgren(MW)琼脂和紫罗兰红胆汁 葡萄糖琼脂(均购自Oxoid,Malmo,瑞典)上,并在计算每克组织或奠便的菌落形成单位 (CFU)之前,在37°C厌氧温育72小时和有氧温育24小时。
[0058]16S rDNA 测序
[0059] 总共随机挑取169个来自结肠和回肠样品的分离株(每只大鼠4-6个分离株)进 行16S rDNA测序(MW琼脂平板:52个结肠分离株,rogosa平板:53个结肠分离株,Rogosa 平板:64个回肠分离株)。粗细胞提取物用作聚合酶链式反应(PCR)的模板。通过正向引物 ENVl 和反向引物ENV2 (表1) (Applied Biosystems,Stockholm,瑞典)扩增 16S rRNA基因。 总共254 1的?0?反应混合物包含0.41^引物£阶1,0.21^引物£阶2,2.51111(^?0? 反应缓冲液(500mM Tris-HCl,100mM KCl,50mM(NH4)2S04,20mM M