本发明属于药物制剂领域，具体地说，涉及一种肿瘤坏死因子舌下给药制剂及其制备方法。
背景技术：
：肿瘤坏死因子α(TumorNecrosisFactorα简称TNFα)是由激活的单核巨噬细胞产生的一种多功能细胞因子。人的有活性的TNFα由3个分子量为17KDa的非糖蛋白单体构成单体呈片层折叠结构，它们之间通过一个Cys69-Cys101间的二硫键非共价组成体。不同种属哺乳动物来源的TNFα在一级结构上具有极高的同源性，在生物学活性上也无明显的种属特异性。纯化的TNFα等电点在5.3左右；pH6-8时稳定；对酸敏感：对蛋白水解酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶等)敏感；50％的饱和硫酸铵可使其沉淀。在反复冻融和无保护剂时，室温下失活。TNFα基因为单拷贝基因。人的基因大小为2.67kb，定位于人第6号染色体。基因组由4个外显子和3个内含子组成；编码一个由233个氨基酸组成的前体蛋白、其前76个氨基酸为信号肽、使TNFα前体能跨膜存在于细胞膜上，通过降解后，分出含157个氨基酸的成熟蛋白、糖基化。人TNFα基因第1外显子编码81％的信号肽，第4外显子编码89％成熟型TNFα氨基酸序列。用TNFα对肿瘤作临床的免疫治疗是几十年来发展较快的新型抗瘤疗法、对临床手术、放疗、化疗等常规手段是有效补充。这在美国、日本和德国都取得了较好的进展。美国的Genentech公司在临床试验中用TNFα治疗乳腺癌、肺癌、结肠癌等方面居于领先地位；Cetus公司把TNFα和IL-2联用开创了复合生物反应调节剂法。日本的重组产品已进入临床试验，对胸、腹水晚期转移癌、大肠癌、胆囊癌等取得了好的进展。德国BASF公司年产可达500g，德国用TNFα在胃肠道肿瘤、肝癌、卵巢肿瘤、乳腺癌等方面取得了成功，尤其在控制癌性胸腹水方面的疗效居世界前列。我国卫生部1998年初已批准上海、西安的5家单位开始临床试验。临床上给药途径早年多为静脉、肌肉和皮下注射，近年来为了减轻TNFα的毒性，常采用局部注射或局部灌注方法，治疗中、晚期肿瘤。给药量从10μg/m2到400μg/m2。较多的治疗方案是2周为1疗程，每个疗程中连续5天给药，每天给50μg/m2。给药量主要取决于药效，通常80万单位/m2有效。虽然1975年已分离、纯化了TNFα，并阐明了结构，1985年已经用大肠杆菌基因工程达到了TNFα的重组产品；但是至今TNFα还停留在临床阶段，世界各国的医药行政部门都未批准TNFα作为商品药在市场上出售。这主要由于从最初的临川试验时发现，TNFα有严重的全身毒性作用，对人的毒性作用要比小鼠高20倍。这种毒性作用主要表现在：发热(35-100％)，寒颤(70-100％)，恶心头痛(20-70％)。乏力(20-77％)、食欲下降(24-46％)；还发生腹泻、血小板降低、白细胞减少、GTP上升、体液潴留、肌痛，甚至内毒素性休克。这就大大限制了TNFα的临床应用剂量，严重影响其治疗肿瘤的效果。至今能选择性地、又直接杀伤肿瘤的药物很少，癌症的死亡率仍高于其他各种疾病。TNFα被发现后大家对其抱有极大的希望。但全身毒性的严重性，限制了它的应用。十几年来各国学者正在千方百计降低TNFα的毒性，主要从两方面取得了一些进展：第一方面是改变给药途径，1990年前后，美国曾经试验用基因治疗，即把TNFα直接注入肿瘤组织。第二方面是用蛋白质工程技术对TNFα的结构进行改造，改造的目的是降低毒性和提高抗肿瘤。十几年来已突变成功了数十种TNFα，其中有些毒性有明显得下降，而抗肿瘤活性有显著提高。虽然如此，各国仍然还在作临床试验。针对目前存在的上述问题，CN00109459.9公开了一种人肿瘤坏死因子α口服剂，含有表达人肿瘤坏死因子α(hTNFα)的念珠藻，降低了毒性，并可直接作用于消化道。本申请人研发的注射用改构重组人肿瘤坏死因子(商品名：天恩福)为国家食品药品监督管理局(SFDA)批准的国家生物制品I类新药，是在肿瘤坏死因子原液中加入人血白蛋白和甘露醇经冻干得到的白色疏松粉末，主要用于治疗恶性淋巴瘤、肺癌、恶性黑色素瘤、恶性胸腹水，具有广阔的应用前景。然而，在长期的使用中发现其毒副反应大，稳定性不好。有鉴于此特提出本发明。技术实现要素：本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种肿瘤坏死因子舌下给药制剂及其制备方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种肿瘤坏死因子舌下给药制剂，其中，所述的肿瘤坏死因子舌下给药制剂包括如下组分：优选，所述的肿瘤坏死因子舌下给药制剂包括如下组分：更优选，所述的肿瘤坏死因子舌下给药制剂包括如下组分：进一步的，所述的肿瘤坏死因子舌下给药制剂为冻干粉末。本发明的肿瘤坏死因子舌下给药制剂用药方便，临用前加入生理盐水复溶，滴入舌下即可，病人带药回家就能用(原静脉给药，必须去医院静脉滴注)，毒副作用小，采用滴入舌下给药，避免了静脉给药的毒副反应大等缺点。本发明还提供所述的肿瘤坏死因子舌下给药制剂的制备方法，其中，所述的制备方法为：先将甘露醇、软磷脂、明胶和甘氨酸配成溶液，混匀，再加入人血白蛋白，混匀，然后再加入肿瘤坏死因子原液，混合均匀，冻干，即得所述的肿瘤坏死因子舌下给药制剂。进一步的，加入肿瘤坏死因子原液时，控制温度在2～8℃。进一步的，在冻干前，将溶液的pH值调节至中性。进一步的，pH值调节用磷酸缓冲液。本发明中，所述的肿瘤坏死因子原液可参照现有技术的方法制备得到，如CN03129262.3所公开的一种重组改构人肿瘤坏死因子的生产方法，也可采用如下方法得到：肿瘤坏死因子工程菌经过发酵，离心得到菌体，匀浆破菌，硫酸铵沉淀，得到目的蛋白，再经过初步精制纯化，得到的蛋白质液体即为肿瘤坏死因子原液。所述的冻干分为预冻、一次干燥和二次干燥三个阶段：预冻：制品进箱前，隔板先降温至0～10℃，然后将制品放入冷冻干燥箱中，用10～60min将隔板温度降至-45±2℃，制品温度达-40℃±2℃，继续保温2～4h；一次干燥：将隔板温度升温至5℃±2℃，保温待制品冰晶完全消失后，继续保温10～14h；对整个系统抽真空，真空度达350±5mbar；二次干燥：将隔板温度升温至30℃±2℃，制品温度达25℃±2℃，保温6～10h。与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)与现有技术相比，本发明增加软磷脂、明胶和甘氨酸后，产品稳定性增加，并添加了有助于吸收的甘氨酸，有利药物快速进入血液，发挥作用；(2)较现有技术相比，本发明的肿瘤坏死因子舌下给药制剂不仅疗效增加，而且无不良反应发生；(3)本发明方法工艺简单，适于工业化大生产。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1处方：制备方法：肿瘤坏死因子工程菌经过发酵，离心得到菌体，匀浆破菌，硫酸铵沉淀，离心得到目的蛋白，再经过初步、精制纯化，得到的高纯度蛋白质液体即为肿瘤坏死因子原液。先将甘露醇、软磷脂、明胶和甘氨酸配成溶液，混匀，再加入人血白蛋白，混匀，然后在温度2℃下加入肿瘤坏死因子原液，混合均匀，用磷酸缓冲液调节pH值至中性，冻干，即得所述的肿瘤坏死因子舌下给药制剂。所述的冻干分为预冻、一次干燥和二次干燥三个阶段：预冻：制品进箱前，隔板先降温至0℃，然后将制品放入冷冻干燥箱中，用10min将隔板温度降至-45±2℃，制品温度达-40℃±2℃，继续保温2h；一次干燥：将隔板温度升温至5℃±2℃，保温待制品冰晶完全消失后，继续保温10h；对整个系统抽真空，真空度达350±5mbar；二次干燥：将隔板温度升温至30℃±2℃，制品温度达25℃±2℃，保温6h。实施例2处方：制备方法：肿瘤坏死因子工程菌经过发酵，离心得到菌体，匀浆破菌，硫酸铵沉淀，离心得到目的蛋白，再经过初步、精制纯化，得到的高纯度蛋白质液体即为肿瘤坏死因子原液。先将甘露醇、软磷脂、明胶和甘氨酸配成溶液，混匀，再加入人血白蛋白，混匀，然后在温度8℃下加入肿瘤坏死因子原液，混合均匀，用磷酸缓冲液调节pH值至中性，冻干，即得所述的肿瘤坏死因子舌下给药制剂。所述的冻干分为预冻、一次干燥和二次干燥三个阶段：预冻：制品进箱前，隔板先降温至10℃，然后将制品放入冷冻干燥箱中，用60min将隔板温度降至-45±2℃，制品温度达-40℃±2℃，继续保温4h；一次干燥：将隔板温度升温至5℃±2℃，保温待制品冰晶完全消失后，继续保温14h；对整个系统抽真空，真空度达350±5mbar；二次干燥：将隔板温度升温至30℃±2℃，制品温度达25℃±2℃，保温10h。实施例3处方：制备方法：肿瘤坏死因子工程菌经过发酵，离心得到菌体，匀浆破菌，硫酸铵沉淀，离心得到目的蛋白，再经过初步、精制纯化，得到的高纯度蛋白质液体即为肿瘤坏死因子原液。先将甘露醇、软磷脂、明胶和甘氨酸配成溶液，混匀，再加入人血白蛋白，混匀，然后在温度4℃下加入肿瘤坏死因子原液，混合均匀，用磷酸缓冲液调节pH值至中性，冻干，即得所述的肿瘤坏死因子舌下给药制剂。所述的冻干分为预冻、一次干燥和二次干燥三个阶段：预冻：制品进箱前，隔板先降温至5℃，然后将制品放入冷冻干燥箱中，用30min将隔板温度降至-45±2℃，制品温度达-40℃±2℃，继续保温3h；一次干燥：将隔板温度升温至5℃±2℃，保温待制品冰晶完全消失后，继续保温12h；对整个系统抽真空，真空度达350±5mbar；二次干燥：将隔板温度升温至30℃±2℃，制品温度达25℃±2℃，保温8h。实施例4处方：制备方法：肿瘤坏死因子工程菌经过发酵，离心得到菌体，匀浆破菌，硫酸铵沉淀，离心得到目的蛋白，再经过初步、精制纯化，得到的高纯度蛋白质液体即为肿瘤坏死因子原液。先将甘露醇、软磷脂、明胶和甘氨酸配成溶液，混匀，再加入人血白蛋白，混匀，然后在温度6℃下加入肿瘤坏死因子原液，混合均匀，用磷酸缓冲液调节pH值至中性，冻干，即得所述的肿瘤坏死因子舌下给药制剂。所述的冻干分为预冻、一次干燥和二次干燥三个阶段：预冻：制品进箱前，隔板先降温至3℃，然后将制品放入冷冻干燥箱中，用35min将隔板温度降至-45±2℃，制品温度达-40℃±2℃，继续保温2.5h；一次干燥：将隔板温度升温至5℃±2℃，保温待制品冰晶完全消失后，继续保温11h；对整个系统抽真空，真空度达350±5mbar；二次干燥：将隔板温度升温至30℃±2℃，制品温度达25℃±2℃，保温7h。实施例5处方：制备方法：肿瘤坏死因子工程菌经过发酵，离心得到菌体，匀浆破菌，硫酸铵沉淀，离心得到目的蛋白，再经过初步、精制纯化，得到的高纯度蛋白质液体即为肿瘤坏死因子原液。先将甘露醇、软磷脂、明胶和甘氨酸配成溶液，混匀，再加入人血白蛋白，混匀，然后在温度6℃下加入肿瘤坏死因子原液，混合均匀，用磷酸缓冲液调节pH值至中性，冻干，即得所述的肿瘤坏死因子舌下给药制剂。所述的冻干分为预冻、一次干燥和二次干燥三个阶段：预冻：制品进箱前，隔板先降温至8℃，然后将制品放入冷冻干燥箱中，用45min将隔板温度降至-45±2℃，制品温度达-40℃±2℃，继续保温3.5h；一次干燥：将隔板温度升温至5℃±2℃，保温待制品冰晶完全消失后，继续保温13h；对整个系统抽真空，真空度达350±5mbar；二次干燥：将隔板温度升温至30℃±2℃，制品温度达25℃±2℃，保温8h。实施例6处方：肿瘤坏死因子工程菌经过发酵，离心得到菌体，匀浆破菌，硫酸铵沉淀，离心得到目的蛋白，再经过初步、精制纯化，得到的高纯度蛋白质液体即为肿瘤坏死因子原液。先将甘露醇、软磷脂、明胶和甘氨酸配成溶液，混匀，再加入人血白蛋白，混匀，然后在温度6℃下加入肿瘤坏死因子原液，混合均匀，用磷酸缓冲液调节pH值至中性，冻干，即得所述的肿瘤坏死因子舌下给药制剂。所述的冻干分为预冻、一次干燥和二次干燥三个阶段：预冻：制品进箱前，隔板先降温至7℃，然后将制品放入冷冻干燥箱中，用18min将隔板温度降至-45±2℃，制品温度达-40℃±2℃，继续保温2.8h；一次干燥：将隔板温度升温至5℃±2℃，保温待制品冰晶完全消失后，继续保温12h；对整个系统抽真空，真空度达350±5mbar；二次干燥：将隔板温度升温至30℃±2℃，制品温度达25℃±2℃，保温9h。对比例1、注射用改构重组人肿瘤坏死因子处方：制备方法：同实施例1，所不同的是处方中不含有软磷脂、明胶和甘氨酸。试验例1、稳定性试验取96孔板，加入细胞数量为2.5～3×105个/ml，细胞板加入样品和标准品后做四倍稀释，做复孔，培养20～24小时后在测量波长570nm，参照波长630nm，测量每孔的OD值。以第几孔为横坐标，孔内细胞量相对应的OD值为纵坐标。根据细胞死亡率，用MTT染色，死亡越多，颜色越淡，采用直线回归计算法进行处理。分别计算各试验样品的半效稀释倍数(即从样品溶液至相当于标准品50％最大效应点的稀释倍数)，并按下式计算试验结果：经过MTT法活性测定，结果如下：实验方法，各加1毫升生理盐水，室温放置1小时。MTT法测定各自活性(原活性85万单位)。1、对比例1的产品活性52万单位；2、增加软磷脂、明胶和甘氨酸后的实施例1的产品的活性80万单位。从上述试验结果可以看出，本发明产品在室温下活性稳定性明显优于对比例1的产品的活性稳定性，是对比例1的产品活性的1.54(80/52)倍。同时，按照上述方法，将实施例1的产品和对比例1的产品各加1毫升生理盐水，在口腔温度37℃下放置1小时。MTT法测定各自活性(原活性85万单位)。1、对比例1的产品活性46万单位；2、增加软磷脂、明胶和甘氨酸后的实施例1的产品的活性76万单位。从上述试验结果可以看出，本发明产品在口腔温度37℃下活性稳定性明显优于对比例1的产品的活性稳定性，是对比例1的产品活性的1.65(76/46)倍。试验例2、临床试验一、资料与方法1、病例选择入选标准：经病理学或细胞学证实的中晚期肺癌、头颈部肿瘤、胃癌、结肠癌、泌尿系统恶性肿瘤患者；年龄35～70岁，心、肝、肾等脏器功能基本正常；白细胞≥4.0×109·L-1，血小板≥100×109·L-1，血红蛋白≥90g·L-1；KPS≥30分，预计生存期＞3个月；至少有1个可评价病灶，近1月内未进行其他抗肿瘤治疗；上述患者均签署书面知情同意书。排除标准：可进行并愿意接受手术治疗的早期恶性肿瘤患者；有明显心、肝、肾功能障碍及血液系统疾病患者；对肽类药物或其他生物制品有过敏史、或有过敏性疾病患者及过敏体质者；孕妇、哺乳期妇女。剔除标准：用药剂量、化疗方案、治疗疗程不符合本研究要求者；因各种原因未完成给药计划者(因不良反应停药者不纳入疗效分析，但纳入不良反应统计)；试验期间加用其他药物影响本试验疗效观察者。共入组120例，其中试验组60例，对照组60例；因各种原因出组7例，其中试验组1例，对照组6例，全组可评价疗效及不良反应者均为113例。试验组59例患者中，男53例，女6例；中位年龄(56.58±9.68)岁。既往治疗20例。KPS评分平均为77.86±7.69。59例中肺癌28例，消化道肿瘤18例，泌尿道肿瘤7例，头颈部肿瘤6例。临床分期：II期3例，III期20例，IV期36例；对照组54例患者中，男37例，女17例，中位年龄(55.91±15.72)岁。既往治疗16例。KPS评分平均为77.36±9.21。肺癌32例，消化道肿瘤22例。经统计学处理，2组患者在性别、年龄、既往治疗、KPS评分、病种及临床分期方面均无统计学差异。2、给药方法试验组：实施例1的舌下给药制剂加联合化疗。用量为400万IU·m-2，d1～d7，d1～d17，舌下给药，21d为1个周期，连用2个周期。联合化疗方案：肺癌GP方案(Gem1200mg/m2iv,d1,d8DDP80－100mg/m2ivd2)；胃癌奥沙利铂+卡培他滨(奥沙利铂130mg·m-2，iv，d1；卡培他滨1000mg·m-2，bid，po，d1-14)；肠癌XELOX方案(奥沙利铂130mg·m-2，iv，d1；卡培他滨1000mg·m-2，bid，po，d1-14)；头颈部肿瘤PF方案(顺铂100mg·m-2，iv，d1；5-Fu1000mg·m-2，iv，d1-4)；泌尿道肿瘤方案同结肠癌。对照组：对比例1的注射用改构重组人肿瘤坏死因子肌注加联合化疗。用量为400万IU·m-2，d1～7，d1～17，im，21d为1个周期，连用2个周期。联合化疗方案同试验组。3、观察指标临床指标：每天记录症状、体征；每日测体温、血压1次，如高热加测体温并记录最高值；每日观察并记录乏力、流涕、畏寒等感冒样症状程度及骨、肌肉疼痛程度；详细记录TNFα给药后的局部不良反应，如注射部位的疼痛程度、红肿硬节范围，有无皮疹及出血点，有无痔疮或溃疡等并记录其他不良反应如过敏反应等。同时判断与药物的相关性。实验室指标：治疗前及治疗开始后每周查血常规；每周期治疗前后查肝、肾功能、尿常规、心电图、肝脏B超及胸部X光片；除可直接测量的肿瘤病灶外，对评价病灶均需治疗前和治疗结束后4周各行CT检测1次。4、疗效评价标准可测量病灶评价标标准：CR可测量病灶完全消失，至少维持4周以上；PR肿块缩小50％以上，时间不少于4周；MR肿瘤病灶的两径乘积缩小≥25％，但＜50％，无新病灶出现；SD肿瘤病灶的两径乘积缩小＜25％，或增加＜25％，无新病灶出现；PD肿瘤病灶两径乘积增大≥25％，或新病灶出现；有效率为CR+PR病例占全部病例的百分数。骨肌肉疼痛程度及注射局部疼痛判定标准参照疼痛主诉分级法(VerbalRatingScale,VRS)判定。0级:无疼痛；Ⅰ级:轻度疼痛,有疼痛感,可忍受,能正常生活,睡眠末受干扰；Ⅱ级:中度疼痛,疼痛明显,不能忍受,要求用止痛药,睡眠受干扰；Ⅲ级:重度疼痛,疼痛剧烈,可伴有植物神经功能紊乱表现,或被动体位,睡眠受严重干扰,须用止痛治疗。注射部位红肿硬结标准:以红肿结节的最大径线的长度(单位为cm)表示。0度:无红肿硬结；Ⅰ度:红肿硬结最大径≤1cm；Ⅱ度:红肿硬节最大径1.1～2.0cm；Ⅲ度:红肿硬结最大径＞2.0cm。乏力及感冒样症状按无、轻度、中度及重度,Ⅳ度判定。5、统计学方法一般资料比较用ⅹ2检验、F检验和等级秩和检验；临床疗效比较用ⅹ2检验和t检验；不良反应发生率用ⅹ2检验和F检验。二、结果1、疗效分析试验组有效率为44.0％(26/59)；对照组有效率为40.7％(22/54),如表1所示,试验组有效率高于对照组。表1、近期疗效比较分组例数CRPRMRSDPDCR+PRRR/％试验组5981771882542.4对照组5481452162240.72、药物不良反应与TNFα有关的不良反应主要为轻度注射部位疼痛、红肿硬结、发热及感冒样症状,试验组为舌下给药，经试验表明无不良反应发生，而对照组不良反应总发生率为72.22％(39/54),见表2。表2、与TNFα相关的不良反应不良反应第1周期(n＝54)(％)第2周期(n＝54)(％)注射部位疼痛36(66.67)39(72.22)红肿硬结12(22.22)24(44.44)发热21(38.89)15(27.78)感冒样症状2(3.70)3(5.56)从上述试验结果可以看出，本发明的舌下给药制剂与注射用改构重组人肿瘤坏死因子肌注给药制剂相比，有效率虽然提高不多，但本发明的舌下给药制剂无不良反应发生，且用药方便、安全。对本发明其它实施例所制备的舌下给药制剂也进行了上述试验，其获得的结果相似。以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本发明的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许变动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。当前第1页1 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