制备负载mRNA的脂质纳米颗粒的改进方法与流程

相关申请的交叉引用本申请要求于2018年8月29日提交的美国临时申请序列号62/724,582以及于2018年8月31日提交的美国临时申请序列号62/725,765的优先权，将这些美国临时申请中每一个的内容并入本文。以引用方式并入序列表于2019年8月16日创建并且大小为17kb的命名为“mrt_2030wo_seq_listing_st25.txt”的文本文件的内容据此整体以引用方式并入。
背景技术：
：信使rna疗法(mrt)正在成为治疗多种疾病的越来越重要的方法。mrt涉及向需要所述疗法的患者施用信使rna(mrna)，以在患者体内产生由所述mrna编码的蛋白质。通常将脂质纳米颗粒用于封装mrna以实现mrna的有效体内递送。为了改善脂质纳米颗粒的递送，许多努力集中在鉴定可以影响例如在各种类型的哺乳动物组织、器官和/或细胞(例如，哺乳动物肝细胞)中的细胞内递送和/或mrna表达的新型脂质或特定脂质组合物上。但是，这些现有方法昂贵、费时且不可预测。技术实现要素：本发明尤其提供了通过将预先形成的脂质纳米颗粒(lnp)与mrna混合来制备负载mrna的脂质纳米颗粒(mrna-lnp)的进一步改进的方法。本发明基于令人惊讶的发现，即在混合步骤期间降低预先形成的lnp和/或mrna的浓度提供了意想不到的益处，诸如避免lnp聚集体的形成和/或减小脂质纳米颗粒的尺寸，同时维持包封效率和mrna回收率。本发明特别地可用于制造具有较低水平的peg修饰的脂质的mrna-lnp用于治疗用途。因此，在一个方面，本发明提供了将信使rna(mrna)包封在脂质纳米颗粒中的方法，所述方法包括：混合包含预先形成的脂质纳米颗粒和mrna的溶液，使得形成包封mrna的脂质纳米颗粒，其中所述预先形成的脂质纳米颗粒和/或所述mrna以不大于0.5mg/ml的浓度存在于所述溶液中。在一些实施方案中，预先形成的脂质纳米颗粒以不大于0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.25mg/ml、0.2mg/ml、0.15mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml或0.01mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，mrna以不大于0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.25mg/ml、0.2mg/ml、0.15mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml或0.01mg/ml的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，所述预先形成的脂质纳米颗粒和所述mrna中的每一者以不大于0.5mg/ml、0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.25mg/ml、0.2mg/ml、0.15mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml或0.01mg/ml的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，所述预先形成的脂质纳米颗粒和所述mrna中的每一者以不大于0.1mg/ml的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，所述预先形成的脂质纳米颗粒和所述mrna中的每一者以不大于0.05mg/ml的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，根据本发明的方法还包括稀释溶液以实现不大于0.5mg/ml的期望浓度的步骤。在一些实施方案中，预先形成的脂质纳米颗粒包含peg修饰的脂质。在一些实施方案中，peg修饰的脂质占脂质纳米颗粒中总脂质的小于3％、小于2.5％、小于2％、小于1.5％或小于1％。在一些实施方案中，peg修饰的脂质占脂质纳米颗粒中总脂质的0.1％至3％、或0.75％至2.5％、或0.5％至2％。在一些实施方案中，peg修饰的脂质占脂质纳米颗粒中总脂质的约1％。在一些实施方案中，包含预先形成的脂质纳米颗粒和mrna的溶液包含小于10mm的柠檬酸盐。在一些实施方案中，包含预先形成的脂质纳米颗粒和mrna的溶液包含小于25％的非水性溶剂。在一些实施方案中，根据本发明的方法包括以下步骤：将一种或多种溶液加热(即，从热源向溶液施加热量)至高于环境温度的温度(或维持在高于环境温度的温度下)，所述一种或多种溶液是包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含mrna的溶液和包含脂质纳米颗粒包封的mrna的混合溶液。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤之前加热mrna溶液和预先形成的脂质纳米颗粒溶液中的一者或两者的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤期间加热以下中的一种或多种：包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含mrna的溶液、和包含脂质纳米颗粒包封的mrna的溶液。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤之后加热脂质纳米颗粒包封的mrna的步骤。在一些实施方案中，一种或多种溶液被加热到的温度(或一种或多种溶液所维持的温度)为或大于约30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃。在一些实施方案中，将一种或多种溶液加热到的温度在从约25-70℃、约30-70℃、约35-70℃、约40-70℃、约45-70℃、约50-70℃或约60-70℃的范围内。在一些实施方案中，一种或多种溶液被加热到的高于环境温度的温度为约65℃。在一些实施方案中，根据本发明的方法包括将包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含mrna的溶液和包含脂质纳米颗粒包封的mrna的混合溶液中的一种或多种维持在环境温度下(即，不从热源向溶液施加热量)。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤之前将mrna溶液和预先形成的脂质纳米颗粒溶液中的一者或两者维持在环境温度的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤期间将以下中的一种或多种维持在环境温度下：包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含mrna的溶液、和包含脂质纳米颗粒包封的mrna的溶液。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤之后将脂质纳米颗粒包封的mrna维持在环境温度下的步骤。在一些实施方案中，一种或多种溶液所维持的环境温度为或小于约35℃、30℃、25℃、20℃或16℃。在一些实施方案中，一种或多种溶液所述维持的环境温度在约15-35℃、约15-30℃、约15-25℃、约15-20℃、约20-35℃、约25-35℃、约30-35℃、约20-30℃、约25-30℃或约20-25℃的范围内。在一些实施方案中，一种或多种溶液所维持的环境温度为20-25℃。在一些实施方案中，根据本发明的方法包括在环境温度下进行以下步骤：将包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液和包含mrna的溶液混合以形成包封mrna的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，通过将溶解在乙醇中的脂质与水性溶液混合来形成预先形成的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，脂质含有一种或多种阳离子脂质、一种或多种辅助脂质和一种或多种peg脂质。在一些实施方案中，脂质还含有一种或多种胆固醇脂质。通过将那些脂质混合而形成预先形成的脂质纳米颗粒。因此，在一些实施方案中，预先形成的脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种辅助脂质和一种或多种peg脂质。在一些实施方案中，预先形成的脂质纳米颗粒还含有一种或多种胆固醇脂质。在一些实施方案中，所述一种或多种阳离子脂质选自由以下项组成的组：ckk-e12、of-02、c12-200、mc3、dlindma、dlinkc2dma、ice(基于咪唑)、hgt5000、hgt5001、hgt4003、dodac、ddab、dmrie、dospa、dogs、dodap、dodma和dmdma、dodac、dlendma、dmrie、clindma、cplindma、dmoba、docarbdap、dlindap、dlincarbdap、dlincdap、dlinssdma、klin-k-dma、dlin-k-xtc2-dma、3-(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)-6-(4-((2-羟基十二烷基)(2-羟基十一烷基)氨基)丁基)-1,4-二噁烷-2,5-二酮(靶标23)、3-(5-(双(2-羟基十二烷基)氨基)戊-2-基)-6-(5-((2-羟基十二烷基)(2-羟基十一烷基)氨基)戊-2-基)-1,4-二噁烷-2,5-二酮(靶标24)、n1gl、n2gl、v1gl、ccbene、ml7、核糖阳离子脂质以及它们的组合。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括ccbene。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括ml7。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包括dlinssdma。在一些实施方案中，所述一种或多种阳离子脂质是氨基脂质。适合用于本发明的氨基脂质包括在wo2017180917中所述的那些，所述专利据此以引用的式并入。在wo2017180917中的示例性氨基脂质包括在段落[0744]中所描述的那些，诸如dlin-mc3-dma(mc3)、(13z,16z)-n,n-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(l608)和化合物18。其他氨基脂质包括化合物2、化合物23、化合物27、化合物10和化合物20。适合用于本发明的另外的氨基脂质包括在wo2017112865中所描述的那些，所述专利据此以引用方式并入。在wo2017112865中的示例性氨基脂质包括根据式(i)、(ial)-(ia6)、(lb)、(ii)、(ila)、(iii)、(ilia)、(iv)、(17-1)、(19-1)、(19-11)和(20-1)中的一个的化合物，以及段落[00185]、[00201]、[0276]的化合物。在一些实施方案中，适合用于本发明的阳离子脂质包括在wo2016118725中所描述的那些，所述专利据此以引用方式并入。在wo2016118725中的示例性阳离子脂质包括诸如kl22和kl25的那些。在一些实施方案中，适合用于本发明的阳离子脂质包括在wo2016118724中所描述的那些，所述专利据此以引用方式并入。在wo2016118725中的示例性阳离子脂质包括诸如kl10、1,2-二亚油基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlin-dma)和kl25。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质选自dspc(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、dppc(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、dope(1,2-二油烯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dopc(1,2-二油烯基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱)、dppe(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dmpe(1,2-二豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dopg(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油))。在一些实施方案中，一种或多种peg修饰的脂质包含长度为最多5kda的聚(乙二醇)链，其共价连接至具有一条或多条c6-c20长度的烷基链的脂质。在一些实施方案中，通过切向流过滤(tff)方法纯化预先形成的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的纯化的纳米颗粒具有小于约150nm(例如，小于约145nm、约140nm、约135nm、约130nm、约125nm、约120nm、约115nm、约110nm、约105nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm、或约50nm)的尺寸。在一些实施方案中，基本上所有的纯化纳米颗粒都具有小于150nm(例如，小于约145nm、约140nm、约135nm、约130nm、约125nm、约120nm、约115nm、约110nm、约105nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm、或约50nm)的尺寸。在一些实施方案中，大于约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的纯化纳米颗粒具有在50-150nm范围内的尺寸。在一些实施方案中，基本上所有的纯化纳米颗粒具有在50-150nm范围内的尺寸。在一些实施方案中，大于约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的纯化纳米颗粒具有在80-150nm范围内的尺寸。在一些实施方案中，基本上所有的纯化纳米颗粒具有在80-150nm范围内的尺寸。在一些实施方案中，根据本发明的方法导致大于约90％、95％、96％、97％、98％或99％的包封率。在一些实施方案中，根据本发明的方法导致回收超过约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的mrna。在一些实施方案中，使用泵系统将预先形成的脂质纳米颗粒和mrna混合。在一些实施方案中，泵系统包含无脉冲流量泵。在一些实施方案中，泵系统是齿轮泵。在一些实施方案中，合适的泵是蠕动泵。在一些实施方案中，合适的泵是离心泵。在一些实施方案中，使用泵系统的方法是大规模进行的。例如，在一些实施方案中，所述方法包括使用如本文所述的泵将至少约1mg、5mg、10mg、50mg、100mg、500mg或1000mgmrna的溶液与预先形成的脂质纳米颗粒的溶液混合，以产生包封在脂质纳米颗粒中的mrna。在一些实施方案中，将mrna与预先形成的脂质纳米颗粒混合的过程提供了根据本发明的组合物，其含有至少约1mg、5mg、10mg、50mg、100mg、500mg或1000mg的包封的mrna。在一些实施方案中，以在从约25-75ml/分钟、约75-200ml/分钟、约200-350ml/分钟、约350-500ml/分钟、约500-650ml/分钟、约650-850ml/分钟、或约850-1000ml/分钟的流速混合包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液。在一些实施方案中，以约50ml/分钟、约100ml/分钟、约150ml/分钟、约200ml/分钟、约250ml/分钟、约300ml/分钟、约350ml/分钟、约400ml/分钟、约450ml/分钟、约500ml/分钟、约550ml/分钟、约600ml/分钟、约650ml/分钟、约700ml/分钟、约750ml/分钟、约800ml/分钟、约850ml/分钟、约900ml/分钟、约950ml/分钟、或约1000ml/分钟的流速混合包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液。在一些实施方案中，将mrna以在约25-75ml/分钟、约75-200ml/分钟、约200-350ml/分钟、约350-500ml/分钟、约500-650ml/分钟、约650-850ml/分钟、或约850-1000ml/分钟范围内的流速混合在溶液中。在一些实施方案中，将mrna以约50ml/分钟、约100ml/分钟、约150ml/分钟、约200ml/分钟、约250ml/分钟、约300ml/分钟、约350ml/分钟、约400ml/分钟、约450ml/分钟、约500ml/分钟、约550ml/分钟、约600ml/分钟、约650ml/分钟、约700ml/分钟、约750ml/分钟、约800ml/分钟、约850ml/分钟、约900ml/分钟、约950ml/分钟、或约1000ml/分钟的流速混合在溶液中。在一些实施方案中，根据本发明的方法包括以下步骤：首先通过将柠檬酸盐缓冲液与溶解在乙醇中的脂质混合来产生预先形成的脂质纳米颗粒溶液。在一些实施方案中，根据本发明的方法包括以下步骤：首先通过将柠檬酸盐缓冲液与mrna储备溶液混合来产生mrna溶液。在某些实施方案中，合适的柠檬酸盐缓冲液含有约10mm柠檬酸盐、约150mmnacl、ph为约4.5。在一些实施方案中，合适的mrna储备溶液含有浓度为或大于约1mg/ml、约10mg/ml、约50mg/ml、或约100mg/ml的mrna。在一些实施方案中，以在约100-300ml/分钟、300-600ml/分钟、600-1200ml/分钟、1200-2400ml/分钟、2400-3600ml/分钟、3600-4800ml/分钟、或4800-6000ml/分钟之间范围内的流速混合柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，以约220ml/分钟、约600ml/分钟、约1200ml/分钟、约2400ml/分钟、约3600ml/分钟、约4800ml/分钟、或约6000ml/分钟的流速混合柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，以在约10-30ml/分钟、约30-60ml/分钟、约60-120ml/分钟、约120-240ml/分钟、约240-360ml/分钟、约360-480ml/分钟、或约480-600ml/分钟之间范围内的流速混合mrna储备溶液。在一些实施方案中，以约20ml/分钟、约40ml/分钟、约60ml/分钟、约80ml/分钟、约100ml/分钟、约200ml/分钟、约300ml/分钟、约400ml/分钟、约500ml/分钟、或约600ml/分钟的流速混合mrna储备溶液。在一些实施方案中，通过将含有mrna的水性溶液与含有预先形成的脂质纳米颗粒的水性溶液混合，用预先形成的脂质纳米颗粒来制备包封mrna的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，含有mrna的水性溶液和/或含有预先形成的脂质纳米颗粒的水性溶液是包含药学上可接受的赋形剂的水性溶液，所述药学上可接受的赋形剂包括但不限于海藻糖、蔗糖、乳糖和甘露糖醇中的一种或多种。在一些实施方案中，在将mrna混合添加到预先形成的脂质纳米颗粒中期间，非水性溶剂(诸如乙醇)和柠檬酸盐中的一者或两者在含有mrna的溶液和含有预先形成的脂质纳米颗粒的溶液中的一者或两者中不存在(即，低于可检测水平)。在一些实施方案中，在将mrna混合添加到预先形成的脂质纳米颗粒中之前，将含有mrna的溶液和含有预先形成的脂质纳米颗粒的溶液中的一者或两者进行缓冲液交换以除去非水性溶剂(诸如乙醇)和柠檬酸盐中的一者或两者。在一些实施方案中，在将mrna混合添加到预先形成的脂质纳米颗粒中期间，含有mrna的溶液和含有预先形成的脂质纳米颗粒的溶液中的一者或两者仅包含残留的柠檬酸盐。在一些实施方案中，含有mrna的溶液和含有预先形成的脂质纳米颗粒的溶液中的一者或两者仅包含残留的非水性溶剂，诸如乙醇。在一些实施方案中，含有mrna的溶液和含有预先形成的脂质纳米颗粒的溶液中的一者或两者包含小于约10mm(例如，小于约9mm、约8mm、约7mm、约6mm、约5mm、约4mm、约3mm、约2mm或约1mm)的在将mrna添加到预先形成的脂质纳米颗粒中期间存在的柠檬酸盐。在一些实施方案中，含有mrna的溶液和含有预先形成的脂质纳米颗粒的溶液中的一者或两者包含小于约25％(例如，小于约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％)的在将mrna添加到预先形成的脂质纳米颗粒中期间存在的非水性溶剂，诸如乙醇。在一些实施方案中，在将预先形成的脂质纳米颗粒和mrna混合以形成所述溶液之后，包含包封mrna的脂质纳米颗粒的溶液不需要任何进一步的下游处理(例如，缓冲液交换和/或进一步的纯化步骤)。在另一个方面，本发明提供了包封通过本文所述的方法产生的mrna的脂质纳米颗粒的组合物。在一些实施方案中，预先形成大量的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，预先形成至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，本发明提供了包含纯化的脂质纳米颗粒的组合物，其中大于约90％的纯化的脂质纳米颗粒具有小于约150nm(例如，小于约145nm、约140nm、约135nm、约130nm、约125nm、约120nm、约115nm、约110nm、约105nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm、或约50nm)的单个颗粒尺寸，并且大于约70％的纯化的脂质纳米颗粒将mrna包封在每个单独的颗粒内。在一些实施方案中，大于约95％、96％、97％、98％或99％的纯化的脂质纳米颗粒具有小于约150nm(例如，小于约145nm、约140nm、约135nm、约130nm、约125nm、约120nm、约115nm、约110nm、约105nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm、或约50nm)的单个颗粒尺寸。在一些实施方案中，基本上所有的纯化的脂质纳米颗粒具有小于约150nm(例如，小于约145nm、约140nm、约135nm、约130nm、约125nm、约120nm、约115nm、约110nm、约105nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm、或约50nm)的单个颗粒尺寸。在一些实施方案中，大于约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的纯化纳米颗粒具有在50-150nm范围内的尺寸。在一些实施方案中，基本上所有的纯化纳米颗粒具有在50-150nm范围内的尺寸。在一些实施方案中，大于约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的纯化纳米颗粒具有在80-150nm范围内的尺寸。在一些实施方案中，基本上所有的纯化纳米颗粒具有在80-150nm范围内的尺寸。在一些实施方案中，大于约90％、95％、96％、97％、98％或99％的纯化的脂质纳米颗粒将mrna包封在每个单独的颗粒内。在一些实施方案中，基本上所有的纯化脂质纳米颗粒在每个单独的颗粒内包封mrna。在一些实施方案中，根据本发明的组合物含有至少约1mg、5mg、10mg、100mg、500mg或1000mg的囊封mrna。在一些实施方案中，预先形成的脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种辅助脂质和一种或多种peg脂质。在一些实施方案中，每个单独的脂质纳米颗粒还包含一种或多种基于胆固醇的脂质。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质选自由以下项组成的组：ckk-e12、of-02、c12-200、mc3、dlindma、dlinkc2dma、ice(基于咪唑)、hgt5000、hgt5001、hgt4003、dodac、ddab、dmrie、dospa、dogs、dodap、dodma和dmdma、dodac、dlendma、dmrie、clindma、cplindma、dmoba、docarbdap、dlindap、dlincarbdap、dlincdap、klin-k-dma、dlin-k-xtc2-dma、3-(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)-6-(4-((2-羟基十二烷基)(2-羟基十一烷基)氨基)丁基)-1,4-二噁烷-2,5-二酮(靶标23)、3-(5-(双(2-羟基十二烷基)氨基)戊-2-基)-6-(5-((2-羟基十二烷基)(2-羟基十一烷基)氨基)戊-2-基)-1,4-二噁烷-2,5-二酮(靶标24)、n1gl、n2gl、v1gl以及它们的组合。在一些实施方案中，所述一种或多种阳离子脂质是氨基脂质。适合用于本发明的氨基脂质包括在wo2017180917中所述的那些，所述专利据此以引用的式并入。在wo2017180917中的示例性氨基脂质包括在段落[0744]中所描述的那些，诸如dlin-mc3-dma(mc3)、(13z,16z)-n,n-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(l608)和化合物18。其他氨基脂质包括化合物2、化合物23、化合物27、化合物10和化合物20。适合用于本发明的另外的氨基脂质包括在wo2017112865中所描述的那些，所述专利据此以引用方式并入。在wo2017112865中的示例性氨基脂质包括根据式(i)、(ial)-(ia6)、(lb)、(ii)、(ila)、(iii)、(ilia)、(iv)、(17-1)、(19-1)、(19-11)和(20-1)中的一个的化合物，以及段落[00185]、[00201]、[0276]的化合物。在一些实施方案中，适合用于本发明的阳离子脂质包括在wo2016118725中所描述的那些，所述专利据此以引用方式并入。在wo2016118725中的示例性阳离子脂质包括诸如kl22和kl25的那些。在一些实施方案中，适合用于本发明的阳离子脂质包括在wo2016118724中所描述的那些，所述专利据此以引用方式并入。在wo2016118725中的示例性阳离子脂质包括诸如kl10、1,2-二亚油基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlin-dma)和kl25。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质选自dspc(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、dppc(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、dope(1,2-二油烯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dopc(1,2-二油烯基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱)、dppe(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dmpe(1,2-二豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、dopg(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油))。在一些实施方案中，所述一种或多种基于胆固醇的脂质是胆固醇或peg化的胆固醇。在一些实施方案中，所述一种或多种peg修饰的脂质含有长度为最多5kda的聚(乙二醇)链，其共价连接至具有一条或多条c6-c20长度的烷基链的脂质。在一些实施方案中，本发明用于包封含有一个或多个经修饰的核苷酸的mrna。在一些实施方案中，一个或多个核苷酸被修饰为假尿苷。在一些实施方案中，一个或多个核苷酸被修饰为5-甲基胞苷。在一些实施方案中，本发明用于包封未经修饰的mrna。在一些实施方案中，根据本发明的方法导致基本上没有脂质纳米颗粒聚集。在其他方面，本发明提供了包含使用本文所述的各种方法制备的负载mrna的lnp的组合物。在一些实施方案中，本发明提供了包含负载mrna的lnp(例如，具有大于80％、90％、95％、98％或99％的包封效率)且基本上没有lnp聚集的组合物。在一些实施方案中，负载mrna的lnp含有低水平的peg修饰的脂质(例如，lnp中总脂质的小于3％、2.5％、2％、1.5％、1％或0.5％)。本发明还提供了递送用于体内蛋白质生产的mrna的方法，所述方法包括向受试者施用包封通过本文所述的方法产生的mrna的脂质纳米颗粒的组合物，其中所述mrna编码一种或多种所关注的蛋白质或肽。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。如本公开中所用，术语“包括”以及该术语的变化形式，诸如“包含”(“comprising”和“comprises”)，并不旨在排除其他添加物、组分、整数或步骤。如本专利申请中使用的，术语“约”和“大约”作为等价物使用。这两个术语均旨在涵盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。在下述详细描述、附图和权利要求书中，本发明的其他特征、目的和优点是显而易见的。然而，应理解，详细描述、附图和权利要求书虽然指出了本发明的实施方案，但仅以说明性方式而非限制性方式给出。在本发明的范围内的各种变化和修改对于所属领域的技术人员将变得显而易见。定义为了使本发明更容易理解，首先在下文定义了某些术语。下述术语和其他术语的另外定义阐述在整个本说明书中。烷基：如本文所用，“烷基”是指具有1个至20个碳原子的直链或支链饱和烃基的基团(“c1-20烷基”)。在一些实施方案中，烷基基团具有1个至3个碳原子(“c1-3烷基”)。c1-3烷基的例子包括甲基(c1)、乙基(c2)、正丙基(c3)和异丙基(c3).在一些实施方案中，烷基基团具有8个至12个碳原子(“c8-12烷基”)。c8-12烷基基团的实例包括但不限于正辛基(c8)、正壬基(c9)、正癸基(c10)、正十一烷基(c11)、正十二烷基(c12)等。前缀“n-”(正)是指非支链的烷基基团。例如，正c8烷基是指-(ch2)7ch3、正c10烷基是指-(ch2)9ch3，等等。氨基酸如本文所用，术语“氨基酸”在其最广泛的意义上是指可以掺入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有一般结构h2n–c(h)(r)–cooh。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是d-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是l-氨基酸。“标准氨基酸”是指在天然存在的肽中通常发现的二十种标准i-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论其是合成制备的还是从天然来源获得的。如本文所用，“合成氨基酸”涵盖化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(例如酰胺)和/或取代物。氨基酸，包括肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸，可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基和/或用其他化学基团取代来修饰，这些化学基团可以改变肽的循环半衰期，而不会对其活性产生不利影响。氨基酸可以参与二硫键。氨基酸可包含一种或多种翻译后修饰，其例如与一种或多种化学实体(例如，甲基基团、乙酸根基团、乙酰基基团、磷酸根基团、甲酰基部分、类异戊二烯基团、硫酸根基团、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分和生物素部分等)结合。术语“氨基酸”与“氨基酸残基”可互换使用，并且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。无论该术语是指游离氨基酸还是肽的残基，从使用该术语的上下文将是显而易见的。动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴子、狗、猫、绵羊、牛、灵长类和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、基因工程动物和/或克隆物。大约或约：如本文所用，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指与所述参考值相似的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”指落入所述值任一方向(大于或小于)中的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的一系列值，除非另有说明或从上下文中另外显而易见的(除非该数字超过可能值的100％)。递送：如本文所用，术语“递送”涵盖局部递送和全身递送。例如，mrna的递送涵盖其中将mrna递送至靶组织并且编码的蛋白质或肽在靶组织内表达且保留的情况(也称为“局部分布”或“局部递送”)，以及其中将mrna递送至靶组织并且编码的蛋白质或肽表达且分泌到患者的循环系统(例如血清)内，并且全身分布且被其他组织吸收的情况(也称为“全身分布”或“全身递送”)。功效：如本文所用，术语“功效”或语法等同物是指与编码相关蛋白质或肽的mrna的递送有关的生物学相关终点的改善。在一些实施方案中，生物学终点是在施用之后的某些时间点针对氯化铵攻击的保护。包封：如本文所用，术语“包封”或语法等同形式是指将单独的mrna分子限制在纳米颗粒内的过程。表达：如本文所用，mrna的“表达”是指将mrna翻译成肽(例如，抗原)、多肽或蛋白质(例如，酶)，并且如上下文所指示还可以包括肽、多肽或完全组装的蛋白质(例如酶)的翻译后修饰。在本申请中，术语“表达”和“产生”以及语法上的等同术语可互换使用。改进、增加或减少：如本文所用，术语“改善”、“增加”或“减少”或语法等同项表示相对于基线测量值，诸如在本文所述治疗开始之前同一个体的测量值，或在没有本文所述治疗的情况下对照样品或受试者(或多个对照样品或受试者)的测量值的值。“对照样品”是除测试物品之外经受与测试样品相同条件的样品。“对照受试者”是患有与所治受试者相同形式的疾病，其年龄与所治受试者大约相同的受试者。杂质:如本文使用的，术语“杂质”是指在限定量的液体、气体或固体内，与目标材料或化合物的化学组成不同的物质。杂质也被称为污染物。体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养物中等，而不是在多细胞生物体内发生的事件。体内：如本文所用，术语“体内”是指在多细胞生物体诸如人和非人动物内发生的事件。在基于细胞的系统的上下文中，该术语可用于指在活细胞内发生的事件(与例如体外系统相反)。分离的：如本文所用，术语“分离的”是指(1)与最初生产时(无论是天然的和/或在实验环境中)与之相关联的至少一些组分分离，和/或(2)由人工生产、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以与最初与它们相关联的其他组分的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％分离。在一些实施方案中，分离的试剂的纯度为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过99％。如本文所用，如果一种物质基本上不含其他组分，则该物质是“纯的”。如本文所用，分离的物质和/或实体的纯度百分比的计算不应包括赋形剂(例如，缓冲剂、溶剂、水等)。局部分布或递送：如本文使用的，术语“局部分布”、“局部递送”或语法等价物指组织特异性递送或分布。通常，局部分布或递送需要由mrna编码的肽或蛋白质(例如酶)在细胞内或伴随有限分泌被翻译且表达，其避免进入患者的循环系统。信使rna(mrna)：如本文所用，术语“信使rna(mrna)”是指编码至少一种肽、多肽或蛋白质的多核苷酸。如本文所用，mrna涵盖经修饰的和未经修饰的rna二者。mrna可以含有一个或多个编码和非编码区。mrna可以从天然来源纯化，使用重组表达系统来产生和任选地纯化，化学合成等。在适当的情况下，例如在化学合成分子的情况下，mrna可以包含核苷类似物，诸如具有化学修饰的碱基或糖、骨架修饰等的类似物。除非另有说明，否则mrna序列的显示方向为5’至3’。在一些实施方案中，mrna是或包含天然核苷(例如，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基胞苷、c-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基尿苷、c5-丙炔基胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、o(6)-甲基鸟苷、2-硫代胞苷、假尿苷和5-甲基胞苷)；化学修饰的碱基；生物修饰的碱基(例如，甲基化碱基)；插入的碱基；改性糖(例如，2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5’-n-亚磷酰胺键)。核酸：如本文所用，术语“核酸”在其最广泛的意义上是指可以掺入多核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是由磷酸二酯键掺入或可以由磷酸二酯键掺入多核苷酸链的化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”是指单独的核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”是指包含单个核酸残基的多核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”涵盖rna以及单链和/或双链dna和/或cdna。此外，术语“核酸”、“dna”、“rna”和/或类似术语包括核酸类似物，即具有除磷酸二酯骨架以外的类似物。患者：如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指可以例如出于实验目的、诊断目的、预防目的、美容目的和/或治疗目的向其施用所提供的组合物的任何生物体。典型的患者包括动物(例如，哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔子、非人类灵长类和/或人类)。在一些实施方案中，患者是人。人包括产前和产后。药学上可接受的：如本文所用，术语“药学上可接受的”是指与合理的受益/风险比相称在合理的医学判断范围内适用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症的物质。药学上可接受的盐：药学上可接受的盐是本领域熟知的。例如，s.m.berge等人在j.pharmaceuticalsciences(1977)66:1-19中描述了药学上可接受的盐。本发明化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机和有机酸和碱的那些盐。药学上可接受的无毒性酸加成盐的实例是氨基与无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和过氯酸)或有机酸(如乙酸、草酸、顺丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、丁二酸或丙二酸)形成的盐，或通过使用所属领域中所用的其他方法(如离子交换)形成的盐。其他药学可接受的盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等等。衍生自适当碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和n+(c1-4烷基)4盐。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。其他药学上可接受的盐包括当适当时使用抗衡离子诸如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、磺酸根和芳基磺酸根形成的无毒的铵、季铵和胺阳离子。其他药学上可接受的盐包括由胺的季铵化形成的盐，所述季铵化使用适当的亲电试剂例如卤代烷进行，以形成季铵化烷基化氨基盐。效力：如本文所用，术语“效力”或语法等同物是指mrna编码的一种或多种蛋白质或肽的表达和/或所产生的生物学效应。盐：如本文所用，术语“盐”是指确实由或可能由酸与碱之间的中和反应产生的离子化合物。全身分布或递送：如本文所用，术语“全身分布”、“全身递送”或语法上的等效物是指影响整个身体或整个生物体的递送或分布机制或方法。通常，全身分布或递送经由身体的循环系统(例如血液)完成。与“局部分布或递送”的定义形成对比。受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括产前和产后。在许多实施方案中，受试者是人。受试者可以是患者，该患者是指向医疗提供者提出进行疾病诊断或治疗的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可以患有疾病或病症或对疾病或病症敏感，但是可以或可以不显示出该疾病或病症的症状。基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出全部或接近全部范围或程度的目标特征或性质的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果曾经有)完成和/或继续完成或达到或避免绝对结果。因此，在本文中使用术语“基本上”来捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在完整性缺失。靶组织：如本文所用，术语“靶组织”是指受待治疗的疾病影响的任何组织。在一些实施方案中，靶组织包括展示疾病相关病理学、症状或特征的那些组织。治疗：如本文所用，术语“治疗”是指用于使特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征部分或完全缓解、转佳、减轻，抑制、预防、延迟其发作，降低其严重性和/或降低其发病率的任何方法。为了降低发展与疾病有关的病理的风险，可以向未表现出疾病征兆和/或仅表现出疾病早期征兆的受试者施用治疗。产率:如本文所用，术语“产率”是指与作为起始材料的总mrna相比，包封后回收的mrna的百分比。在一些实施方案中，术语“回收率”与术语“产率”可互换使用。具体实施方式本发明提供了基于混合低浓度的预先形成的lnp和mrna而进行脂质纳米颗粒(lnp)调配和mrna包封的改进方法。在一些实施方案中，将预先形成的lnp和mrna中的一者或两者以不大于1mg/ml(例如，不大于0.9mg/ml、不大于0.8mg/ml、不大于0.7mg/ml、不大于0.6mg/ml、不大于0.5mg/ml、不大于0.4mg/ml、不大于0.3mg/ml、不大于0.2mg/ml、不大于0.1mg/ml、不大于0.09mg/ml、不大于0.08mg/ml、不大于0.07mg/ml、不大于0.06mg/ml、不大于0.05mg/ml、不大于0.04mg/ml、不大于0.03mg/ml、不大于0.02mg/ml、或不大于0.01mg/ml)的浓度混合以进行包封。在一些实施方案中，本发明的脂质纳米颗粒调配物和制备方法的所得包封效率为90％左右。对于核酸的递送，实现高包封效率对于获得药物物质保护并减少体内活性丧失至关重要。另外，通过本发明中的新颖方法制备的脂质纳米颗粒调配物的令人惊讶的结果是在体外观察到的转染效率显著更高。在以下部分中详细描述了本发明的各个方面。部分的使用并不意在限制本发明。每个部分可以适用于本发明的任何方面。信使rna(mrna)本发明可以用于包封任何mrna。mrna通常被认为是将信息从dna携带到核糖体的rna类型。通常，在真核生物体中，mrna加工包括在5'末端添加一个“帽”，并且在3'末端添加一个“尾巴”。典型的帽是7-甲基鸟苷帽，其是通过5'-5'-三磷酸键与第一个转录的核苷酸连接的鸟苷。帽的存在对于提供对存在于大多数真核细胞中的核酸酶的抗性很重要。尾巴的添加通常是聚腺苷酸化事件，由此聚腺苷酰基部分被添加到mrna分子的3'末端。这种“尾巴”的存在用于保护mrna免受核酸外切酶降解。信使rna被核糖体翻译成组成蛋白质的一系列氨基酸。可以根据多种已知方法中的任一种合成mrna。例如，可以通过体外转录(ivt)合成根据本发明的mrna。简而言之，ivt通常使用线性或环状dna模板进行，该模板包含启动子，三磷酸核糖核苷酸库，可能包含dtt和镁离子的缓冲系统以及适当的rna聚合酶(例如，t3、t7或sp6rna聚合酶)，dnasei，焦磷酸酶和/或rnase抑制剂。确切条件将根据具体应用而改变。在一些实施方案中，可以在调配和包封之前纯化体外合成的mrna，以除去不期望的杂质(包括在mrna合成过程中使用的各种酶和其他试剂)。本发明可以用于调配和包封各种长度的mrna。在一些实施方案中，本发明可以用于调配和包封长度等于或大于约1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb或20kb的体外合成的mrna。在一些实施方案中，本发明可以用于调配和包封长度在约1-20kb、约1-15kb、约1-10kb、约5-20kb、约5-15kb、约5-12kb、约5-10kb、约8-20kb或约8-15kb范围内的体外合成的mrna。本发明可以用于调配和包封未经修饰的mrna或者含有通常增强稳定性的一个或多个修饰的mrna。在一些实施方案中，修饰选自经修饰的核苷酸、经修饰的糖磷酸主链以及5’和/或3’非翻译区。在一些实施方案中，mrna的修饰可以包括rna的核苷酸的修饰。根据本发明的经修饰的mrna可以包括例如主链修饰、糖修饰或碱基修饰。在一些实施方案中，mrna可以从天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物(经修饰的核苷酸)合成，所述天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物包括但不限于嘌呤(腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g))或嘧啶(胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)、尿嘧啶(u))以及嘌呤和嘧啶的经修饰的核苷酸类似物或衍生物，例如1-甲基-腺嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-n-6-异戊烯基-腺嘌呤、n6-甲基-腺嘌呤、n6-异戊烯基-腺嘌呤、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰基-胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤、2-甲基-鸟嘌呤、2,2-二甲基-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-(羧羟甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶、n-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、1-甲基-假尿嘧啶、q核苷、β-d-甘露糖基-q核苷、怀丁苷和氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-脱氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、5-甲基胞苷和肌苷。此类类似物的制备是本领域的技术人员已知的，例如来自美国专利号4,373,071、美国专利号4,401,796、美国专利号4,415,732、美国专利号4,458,066、美国专利号4,500,707、美国专利号4,668,777、美国专利号4,973,679、美国专利号5,047,524、美国专利号5,132,418、美国专利号5,153,319、美国专利号5,262,530和5,700,642，这些专利的全部公开内容以引用的方式包括于本文中。通常，mrna合成包括在5'末端上添加“帽”和在3'末端上添加“尾”。帽的存在对于提供对存在于大多数真核细胞中的核酸酶的抗性很重要。“尾巴”的存在用于保护mrna免受核酸外切酶降解。因此，在一些实施方案中，mrna包括5’帽结构。通常按如下方式添加5’帽：首先，rna末端磷酸酶从5’核苷酸除去一个末端磷酸基团，剩下两个末端磷酸酯；然后通过鸟苷酸转移酶将三磷酸鸟苷(gtp)加入末端磷酸酯中，产生5’5’5三磷酸酯键；然后用甲基转移酶将鸟嘌呤的7-氮甲基化。2’-o-甲基化也可以出现在7-甲基鸟苷三磷酸残基之后的第一碱基和/或第二碱基处。帽结构的实例包括但不限于m7gpppnp-rna、m7gpppnmp-rna和m7gpppnmpnmp-rna(其中m表示2’-o-甲基残基)。在一些实施方案中，mrna包括5’和/或3’非翻译区。在一些实施方案中，5’非翻译区包括一个或多个影响mrna的稳定性或翻译的元件，例如铁应答元件。在一些实施方案中，5’非翻译区的长度可以在约50和500个核苷酸之间。在一些实施方案中，3’非翻译区包括一个或多个聚腺苷酸化信号，影响mrna在细胞中定位稳定性的蛋白质结合位点，或一个或多个mirna结合位点。在一些实施方案中，3’非翻译区的长度可以在50和500个核苷酸之间或更长。虽然在一些实施方案中体外转录反应所提供的mrna是所期望的，但是在本发明的范围内设想了mrna的其他来源，包括从细菌、真菌、植物和/或动物产生的mrna。本发明可以用于调配和包封编码各种蛋白质的mrna。适合用于本发明的mrna的非限制性实例包括编码脊髓运动神经元1(smn)、α-半乳糖苷酶(gla)、精氨琥珀酸合成酶(ass1)、鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)、因子ix(fix)、苯丙氨酸羟化酶(pah)、促红细胞生成素(epo)、囊性纤维化跨膜传导调节因子(cftr)和萤火虫萤光素酶(ffl)。下面列出了本文所公开的示例性mrna序列：密码子优化的人otc编码序列augcuguucaaccuucggaucuugcugaacaacgcugcguuccggaauggucacaacuucaugguccggaacuucagaugcggccagccgcuccagaacaaggugcagcucaaggggagggaccuccucacccugaaaaacuucaccggagaagagaucaaguacaugcuguggcugucagccgaccucaaauuccggaucaagcagaagggcgaauaccuuccuuugcugcagggaaagucccuggggaugaucuucgagaagcgcagcacucgcacuagacugucaacugaaaccggcuucgcgcugcugggaggacaccccugcuuccugaccacccaagauauccaucugggugugaacgaaucccucaccgacacagcgcgggugcugucguccauggcagacgcgguccucgcccgcguguacaagcagucugaucuggacacucuggccaaggaagccuccauuccuaucauuaauggauuguccgaccucuaccaucccauccagauucuggccgauuaucugacucugcaagaacauuacagcucccugaaggggcuuacccuuucguggaucggcgacggcaacaacauucugcacagcauuaugaugagcgcugccaaguuuggaaugcaccuccaagcagcgaccccgaagggauacgagccagacgccuccgugacgaagcuggcugagcaguacgccaaggagaacggcacuaagcugcugcucaccaacgacccucucgaagccgcccacgguggcaacgugcugaucaccgauaccuggaucuccaugggacaggaggaggaaaagaagaagcgccugcaagcauuucagggguaccaggugacuaugaaaaccgccaaggucgccgccucggacuggaccuucuugcacugucugcccagaaagcccgaagagguggacgacgagguguucuacagcccgcggucgcuggucuuuccggaggccgaaaacaggaaguggacuaucauggccgugauggugucccugcugaccgauuacuccccgcagcugcagaaaccaaaguucuga(seqidno:1)密码子优化的人ass1编码序列augagcagcaagggcagcguggugcuggccuacagcggcggccuggacaccagcugcauccugguguggcugaaggagcagggcuacgacgugaucgccuaccuggccaacaucggccagaaggaggacuucgaggaggcccgcaagaaggcccugaagcugggcgccaagaagguguucaucgaggacgugagccgcgaguucguggaggaguucaucuggcccgccauccagagcagcgcccuguacgaggaccgcuaccugcugggcaccagccuggcccgccccugcaucgcccgcaagcagguggagaucgcccagcgcgagggcgccaaguacgugagccacggcgccaccggcaagggcaacgaccaggugcgcuucgagcugagcugcuacagccuggccccccagaucaaggugaucgcccccuggcgcaugcccgaguucuacaaccgcuucaagggccgcaacgaccugauggaguacgccaagcagcacggcauccccauccccgugacccccaagaaccccuggagcauggacgagaaccugaugcacaucagcuacgaggccggcauccuggagaaccccaagaaccaggccccccccggccuguacaccaagacccaggaccccgccaaggcccccaacacccccgacauccuggagaucgaguucaagaagggcgugcccgugaaggugaccaacgugaaggacggcaccacccaccagaccagccuggagcuguucauguaccugaacgagguggccggcaagcacggcgugggccgcaucgacaucguggagaaccgcuucaucggcaugaagagccgcggcaucuacgagacccccgccggcaccauccuguaccacgcccaccuggacaucgaggccuucaccauggaccgcgaggugcgcaagaucaagcagggccugggccugaaguucgccgagcugguguacaccggcuucuggcacagccccgagugcgaguucgugcgccacugcaucgccaagagccaggagcgcguggagggcaaggugcaggugagcgugcugaagggccagguguacauccugggccgcgagagcccccugagccuguacaacgaggagcuggugagcaugaacgugcagggcgacuacgagcccaccgacgccaccggcuucaucaacaucaacagccugcgccugaaggaguaccaccgccugcagagcaaggugaccgccaaguga(seqidno:2)密码子优化的人cftr编码序列augcaacgcucuccucuugaaaaggccucggugguguccaagcucuucuucucguggacuagacccauccugagaaagggguacagacagcgcuuggagcuguccgauaucuaucaaaucccuuccguggacuccgcggacaaccuguccgagaagcucgagagagaaugggacagagaacucgccucaaagaagaacccgaagcugauuaaugcgcuuaggcggugcuuuuucuggcgguucauguucuacggcaucuuccucuaccugggagaggucaccaaggccgugcagccccuguugcugggacggauuauugccuccuacgaccccgacaacaaggaagaaagaagcaucgcuaucuacuugggcaucggucugugccugcuuuucaucguccggacccucuuguugcauccugcuauuuucggccugcaucacauuggcaugcagaugagaauugccauguuuucccugaucuacaagaaaacucugaagcucucgagccgcgugcuugacaagauuuccaucggccagcucgugucccugcucuccaacaaucugaacaaguucgacgagggccucgcccuggcccacuucguguggaucgccccucugcaaguggcgcuucugaugggccugaucugggagcugcugcaagccucggcauucugugggcuuggauuccugaucgugcuggcacuguuccaggccggacuggggcggaugaugaugaaguacagggaccagagagccggaaagauuuccgaacggcuggugaucacuucggaaaugaucgaaaacauccagucagugaaggccuacugcugggaagaggccauggaaaagaugauugaaaaccuccggcaaaccgagcugaagcugacccgcaaggccgcuuacgugcgcuauuucaacucguccgcuuucuucuucuccggguucuucgugguguuucucuccgugcuccccuacgcccugauuaagggaaucauccucaggaagaucuucaccaccauuuccuucuguaucgugcuccgcauggccgugacccggcaguucccaugggccgugcagacuugguacgacucccugggagccauuaacaagauccaggacuuccuucaaaagcaggaguacaagacccucgaguacaaccugacuacuaccgaggucgugauggaaaacgucaccgccuuuugggaggagggauuuggcgaacuguucgagaaggccaagcagaacaacaacaaccgcaagaccucgaacggugacgacucccucuucuuuucaaacuucagccugcucgggacgcccgugcugaaggacauuaacuucaagaucgaaagaggacagcuccuggcgguggccggaucgaccggagccggaaagacuucccugcugauggugaucaugggagagcuugaaccuagcgagggaaagaucaagcacuccggccgcaucagcuucuguagccaguuuuccuggaucaugcccggaaccauuaaggaaaacaucaucuucggcguguccuacgaugaauaccgcuaccgguccgugaucaaagccugccagcuggaagaggauauuucaaaguucgcggagaaagauaacaucgugcugggcgaaggggguauuaccuugucggggggccagcgggcuagaaucucgcuggccagagccguguauaaggacgccgaccuguaucuccuggacucccccuucggauaccuggacguccugaccgaaaaggagaucuucgaaucgugcgugugcaagcugauggcuaacaagacucgcauccucgugaccuccaaaauggagcaccugaagaaggcagacaagauucugauucugcaugagggguccuccuacuuuuacggcaccuucucggaguugcagaacuugcagcccgacuucucaucgaagcugauggguugcgacagcuucgaccaguucuccgccgaaagaaggaacucgauccugacggaaaccuugcaccgcuucucuuuggaaggcgacgccccugugucauggaccgagacuaagaagcagagcuucaagcagaccggggaauucggcgaaaagaggaagaacagcaucuugaaccccauuaacuccauccgcaaguucucaaucgugcaaaagacgccacugcagaugaacggcauugaggaggacuccgacgaaccccuugagaggcgccugucccuggugccggacagcgagcagggagaagccauccugccucggauuuccgugaucuccacugguccgacgcuccaagcccggcggcggcaguccgugcugaaccugaugacccacagcgugaaccagggccaaaacauucaccgcaagacuaccgcauccacccggaaagugucccuggcaccucaagcgaaucuuaccgagcucgacaucuacucccggagacugucgcaggaaaccgggcucgaaauuuccgaagaaaucaacgaggaggaucugaaagagugcuucuucgacgauauggagucgauacccgccgugacgacuuggaacacuuaucugcgguacaucacugugcacaagucauugaucuucgugcugauuuggugccuggugauuuuccuggccgaggucgcggccucacugguggugcucuggcuguugggaaacacgccucugcaagacaagggaaacuccacgcacucgagaaacaacagcuaugccgugauuaucacuuccaccuccucuuauuacguguucuacaucuacgucggaguggcggauacccugcucgcgauggguuucuucagaggacugccgcugguccacaccuugaucaccgucagcaagauucuucaccacaagauguugcauagcgugcugcaggcccccauguccacccucaacacucugaaggccggaggcauucugaacagauucuccaaggacaucgcuauccuggacgaucuccugccgcuuaccaucuuugacuucauccagcugcugcugaucgugauuggagcaaucgcagugguggcggugcugcagccuuacauuuucguggccacugugccggucauuguggcguucaucaugcugcgggccuacuuccuccaaaccagccagcagcugaagcaacuggaauccgagggacgaucccccaucuucacucaccuugugacgucguugaagggacuguggacccuccgggcuuucggacggcagcccuacuucgaaacccucuuccacaaggcccugaaccuccacaccgccaauugguuccuguaccuguccacccugcggugguuccagaugcgcaucgagaugauuuucgucaucuucuucaucgcggucacauucaucagcauccugacuaccggagagggagagggacgggucggaauaauccugacccucgccaugaacauuaugagcacccugcagugggcagugaacagcucgaucgacguggacagccugaugcgaagcgucagccgcguguucaaguucaucgacaugccuacugagggaaaacccacuaaguccacuaagcccuacaaaaauggccagcugagcaaggucaugaucaucgaaaacucccacgugaagaaggacgauauuuggcccuccggaggucaaaugaccgugaaggaccugaccgcaaaguacaccgagggaggaaacgccauucucgaaaacaucagcuucuccauuucgccgggacagcgggucggccuucucgggcggaccgguuccgggaagucaacucugcugucggcuuuccuccggcugcugaauaccgagggggaaauccaaauugacggcgugucuugggauuccauuacucugcagcaguggcggaaggccuucggcgugaucccccagaagguguucaucuucucggguaccuuccggaagaaccuggauccuuacgagcaguggagcgaccaagaaaucuggaaggucgccgacgaggucggccugcgcuccgugauugaacaauuuccuggaaagcuggacuucgugcucgucgacgggggauguguccugucgcacggacauaagcagcucaugugccucgcacgguccgugcucuccaaggccaagauucugcugcuggacgaaccuucggcccaccuggauccggucaccuaccagaucaucaggaggacccugaagcaggccuuugccgauugcaccgugauucucugcgagcaccgcaucgaggccaugcuggagugccagcaguuccuggucaucgaggagaacaagguccgccaauacgacuccauucaaaagcuccucaacgagcggucgcuguucagacaagcuauuucaccguccgauagagugaagcucuucccgcaucggaacagcucaaagugcaaaucgaagccgcagaucgcagccuugaaggaagagacugaggaagaggugcaggacacccggcuuuaa(seqidno:3)比较密码子优化的人cftrmrna编码序列augcagcgguccccgcucgaaaaggccagugucguguccaaacucuucuucucauggacucggccuauccuuagaaagggguaucggcagaggcuugaguugucugacaucuaccagauccccucgguagauucggcggauaaccucucggagaagcucgaacgggaaugggaccgcgaacucgcgucuaagaaaaacccgaagcucaucaacgcacugagaaggugcuucuucuggcgguucauguucuacgguaucuucuuguaucucggggaggucacaaaagcaguccaaccccuguuguugggucgcauuaucgccucguacgaccccgauaacaaagaagaacggagcaucgcgaucuaccucgggaucggacuguguuugcuuuucaucgucagaacacuuuuguugcauccagcaaucuucggccuccaucacaucgguaugcagaugcgaaucgcuauguuuagcuugaucuacaaaaagacacugaaacucucgucgcggguguuggauaagauuuccaucggucaguuggugucccugcuuaguaauaaccucaacaaauucgaugagggacuggcgcuggcacauuucguguggauugccccguugcaagucgcccuuuugaugggccuuauuugggagcuguugcaggcaucugccuuuuguggccugggauuucugauuguguuggcauuguuucaggcugggcuugggcggaugaugaugaaguaucgcgaccagagagcggguaaaaucucggaaagacucgucaucacuucggaaaugaucgaaaacauccagucggucaaagccuauugcugggaagaagcuauggagaagaugauugaaaaccuccgccaaacugagcugaaacugacccgcaaggcggcguauguccgguauuucaauucgucagcguucuucuuuuccggguucuucguugucuuucucucgguuuugccuuaugccuugauuaaggggauuauccuccgcaagauuuucaccacgauuucguucugcauuguauugcgcauggcagugacacggcaauuuccgugggccgugcagacaugguaugacucgcuuggagcgaucaacaaaauccaagacuucuugcaaaagcaagaguacaagacccuggaguacaaucuuacuacuacggagguaguaauggagaaugugacggcuuuuugggaagaggguuuuggagaacuguuugagaaagcaaagcagaauaacaacaaccgcaagaccucaaauggggacgauucccuguuuuucucgaacuucucccugcucggaacacccguguugaaggacaucaauuucaagauugagaggggacagcuucucgcgguagcgggaagcacuggugcgggaaaaacuagccucuugauggugauuaugggggagcuugagcccagcgaggggaagauuaaacacuccgggcguaucucauucuguagccaguuuucauggaucaugcccggaaccauuaaagagaacaucauuuucggaguauccuaugaugaguaccgauacagaucggucauuaaggcgugccaguuggaagaggacauuucuaaguucgccgagaaggauaacaucgucuugggagaaggggguauuacauugucgggagggcagcgagcgcggaucagccucgcgagagcgguauacaaagaugcagauuuguaucugcuugauucaccguuuggauaccucgacguauugacagaaaaagaaaucuucgagucgugcguguguaaacuuauggcuaauaagacgagaauccuggugacaucaaaaauggaacaccuuaagaaggcggacaagauccugauccuccacgaaggaucguccuacuuuuacggcacuuucucagaguugcaaaacuugcagccggacuucucaagcaaacucauggggugugacucauucgaccaguucagcgcggaacggcggaacucgaucuugacggaaacgcugcaccgauucucgcuugagggugaugccccgguaucguggaccgagacaaagaagcagucguuuaagcagacaggagaauuuggugagaaaagaaagaacaguaucuugaauccuauuaacucaauucgcaaguucucaaucguccagaaaacuccacugcagaugaauggaauugaagaggauucggacgaaccccuggagcgcaggcuuagccucgugccggauucagagcaaggggaggccauucuuccccggauuucggugauuucaaccggaccuacacuucaggcgaggcgaaggcaauccgugcucaaccucaugacgcauucgguaaaccaggggcaaaacauucaccgcaaaacgacggccucaacgagaaaagugucacuugcaccccaggcgaauuugacugaacucgacaucuacagccguaggcuuucgcaagaaaccggacuugagaucagcgaagaaaucaaugaagaagauuugaaagaguguuucuuugaugacauggaaucaaucccagcggugacaacguggaacacauacuugcguuacaucacggugcacaaguccuugauuuucguccucaucuggugucucgugaucuuucucgcugaggucgcagcgucacuugugguccucuggcugcuugguaauacgcccuugcaagacaaaggcaauucuacacacucaagaaacaauuccuaugccgugauuaucacuucuacaagcucguauuacguguuuuacaucuacguaggaguggccgacacucugcucgcgauggguuucuuccgaggacucccacucguucacacgcuuaucacugucuccaagauucuccaccauaagaugcuucauagcguacugcaggcucccauguccaccuugaauacgcucaaggcgggagguauuuugaaucgcuucucaaaagauauugcaauuuuggaugaccuucugccccugacgaucuucgacuucauccaguuguugcugaucgugauuggggcuauugcaguagucgcuguccuccagccuuacauuuuugucgcgaccguuccggugaucguggcguuuaucaugcugcgggccuauuucuugcagacgucacagcagcuuaagcaacuggagucugaagggaggucgccuaucuuuacgcaucuugugaccaguuugaagggauuguggacguugcgcgccuuuggcaggcagcccuacuuugaaacacuguuccacaaagcgcugaaucuccauacggcaaauugguuuuuguauuugaguacccuccgaugguuucagaugcgcauugagaugauuuuugugaucuucuuuaucgcggugacuuuuaucuccaucuugaccacgggagagggcgagggacgggucgguauuauccugacacucgccaugaacauuaugagcacuuugcagugggcagugaacagcucgauugauguggauagccugaugagguccguuucgagggucuuuaaguucaucgacaugccgacggagggaaagcccacaaaaaguacgaaacccuauaagaaugggcaauugaguaagguaaugaucaucgagaacagucacgugaagaaggaugacaucuggccuagcgggggucagaugaccgugaaggaccugacggcaaaauacaccgagggagggaacgcaauccuugaaaacaucucguucagcauuagccccggucagcgugugggguugcucgggaggaccgggucaggaaaaucgacguugcugucggccuucuugagacuucugaauacagagggugagauccagaucgacggcguuucgugggauagcaucaccuugcagcaguggcggaaagcguuuggaguaaucccccaaaaggucuuuaucuuuagcggaaccuuccgaaagaaucucgauccuuaugaacaguggucagaucaagagauuuggaaagucgcggacgagguuggccuucggaguguaaucgagcaguuuccgggaaaacucgacuuuguccuuguagaugggggaugcguccugucgcaugggcacaagcagcucaugugccuggcgcgauccguccucucuaaagcgaaaauucuucucuuggaugaaccuucggcccaucuggacccgguaacguaucagaucaucagaaggacacuuaagcaggcguuugccgacugcacggugauucucugugagcaucguaucgaggccaugcucgaaugccagcaauuucuugucaucgaagagaauaagguccgccaguacgacuccauccagaagcugcuuaaugagagaucauuguuccggcaggcgauuucaccauccgauagggugaaacuuuuuccacacagaaauucgucgaagugcaaguccaaaccgcagaucgcggccuugaaagaagagacugaagaagaaguucaagacacgcgucuuuaa(seqidno:4)密码子优化的人pah编码序列augagcaccgccgugcuggagaaccccggccugggccgcaagcugagcgacuucggccaggagaccagcuacaucgaggacaacugcaaccagaacggcgccaucagccugaucuucagccugaaggaggaggugggcgcccuggccaaggugcugcgccuguucgaggagaacgacgugaaccugacccacaucgagagccgccccagccgccugaagaaggacgaguacgaguucuucacccaccuggacaagcgcagccugcccgcccugaccaacaucaucaagauccugcgccacgacaucggcgccaccgugcacgagcugagccgcgacaagaagaaggacaccgugcccugguucccccgcaccauccaggagcuggaccgcuucgccaaccagauccugagcuacggcgccgagcuggacgccgaccaccccggcuucaaggaccccguguaccgcgcccgccgcaagcaguucgccgacaucgccuacaacuaccgccacggccagcccaucccccgcguggaguacauggaggaggagaagaagaccuggggcaccguguucaagacccugaagagccuguacaagacccacgccugcuacgaguacaaccacaucuucccccugcuggagaaguacugcggcuuccacgaggacaacaucccccagcuggaggacgugagccaguuccugcagaccugcaccggcuuccgccugcgccccguggccggccugcugagcagccgcgacuuccugggcggccuggccuuccgcguguuccacugcacccaguacauccgccacggcagcaagcccauguacacccccgagcccgacaucugccacgagcugcugggccacgugccccuguucagcgaccgcagcuucgcccaguucagccaggagaucggccuggccagccugggcgcccccgacgaguacaucgagaagcuggccaccaucuacugguucaccguggaguucggccugugcaagcagggcgacagcaucaaggccuacggcgccggccugcugagcagcuucggcgagcugcaguacugccugagcgagaagcccaagcugcugccccuggagcuggagaagaccgccauccagaacuacaccgugaccgaguuccagccccuguacuacguggccgagagcuucaacgacgccaaggagaaggugcgcaacuucgccgccaccaucccccgccccuucagcgugcgcuacgaccccuacacccagcgcaucgaggugcuggacaacacccagcagcugaagauccuggccgacagcaucaacagcgagaucggcauccugugcagcgcccugcagaagaucaaguaa(seqidno:5)在一些实施方案中，适合用于本发明的mrna具有与seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:4至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，适合用于本发明的mrna包含与seqidno:1、seqidno:2、seqid:no3或seqid:no4相同的核苷酸序列。mrna溶液可以在溶液中提供mrna以与脂质溶液混合，使得可以将mrna包封在脂质纳米颗粒中。合适的mrna溶液可以是含有待以低于1mg/ml的各种浓度包封的mrna的任何水性溶液。例如，合适的mrna溶液可以含有浓度为或小于约0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、或1.0mg/ml的mrna。通常，合适的mrna溶液还可以含有缓冲剂和/或盐。一般来讲，缓冲剂可以包括hepes、硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾和磷酸钠。在一些实施方案中，缓冲剂的合适浓度可以在约0.1mm至100mm、0.5mm至90mm、1.0mm至80mm、2mm至70mm、3mm至60mm、4mm至50mm、5mm至40mm、6mm至30mm、7mm至20mm、8mm至15mm、或9至12mm的范围内。在一些实施方案中，缓冲剂的合适浓度为或大于约0.1mm、0.5mm、1mm、2mm、4mm、6mm、8mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm或50mm。示例性的盐可包括氯化钠、氯化镁和氯化钾。在一些实施方案中，mrna溶液中盐的合适浓度可以在约1mm至500mm、5mm至400mm、10mm至350mm、15mm至300mm、20mm至250mm、30mm至200mm、40mm至190mm、50mm至180mm、50mm至170mm、50mm至160mm、50mm至150mm、或50mm至100mm的范围内。在合适的mrna溶液中的盐浓度为或大于约1mm、5mm、10mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm或100mm。在一些实施方案中，合适的mrna溶液可以具有在约3.5-6.5、3.5-6.0、3.5-5.5.、3.5-5.0、3.5-4.5、4.0-5.5、4.0-5.0、4.0-4.9、4.0-4.8、4.0-4.7、4.0-4.6、或4.0-4.5范围内的ph。在一些实施方案中，合适的mrna溶液可以具有为或不大于约3.5、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.1、6.3和6.5的ph。可以使用各种方法来制备适合用于本发明的mrna溶液。在一些实施方案中，可以将mrna直接溶解在本文所述的缓冲溶液中。在一些实施方案中，可以通过在与脂质溶液混合以进行包封之前将mrna储备溶液与缓冲溶液混合来产生mrna溶液。在一些实施方案中，可以通过在与脂质溶液混合以进行包封之前立即将mrna储备溶液与缓冲溶液混合来产生mrna溶液。在一些实施方案中，合适的mrna储备溶液可以在水中含有浓度为或大于约0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、or1.6mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、或5.0mg/ml的mrna。在一些实施方案中，使用泵将mrna储备溶液与缓冲溶液混合。示例性的泵包括但不限于齿轮泵、蠕动泵和离心泵。通常，以比mrna储备溶液的流速更大的流速混合缓冲溶液。例如，可以以比mrna储备溶液的流速大至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍的流速混合缓冲溶液。在一些实施方案中，以在约100-6000ml/分钟(例如，约100-300ml/分钟、300-600ml/分钟、600-1200ml/分钟、1200-2400ml/分钟、2400-3600ml/分钟、3600-4800ml/分钟、4800-6000ml/分钟、或60-420ml/分钟)之间范围内的流速混合缓冲溶液。在一些实施方案中，以为或大于约60ml/分钟、100ml/分钟、140ml/分钟、180ml/分钟、220ml/分钟、260ml/分钟、300ml/分钟、340ml/分钟、380ml/分钟、420ml/分钟、480ml/分钟、540ml/分钟、600ml/分钟、1200ml/分钟、2400ml/分钟、3600ml/分钟、4800ml/分钟、或6000ml/分钟的流速混合缓冲溶液。在一些实施方案中，以在约10-600ml/分钟(例如，约5-50ml/分钟、约10-30ml/分钟、约30-60ml/分钟、约60-120ml/分钟、约120-240ml/分钟、约240-360ml/分钟、约360-480ml/分钟、或约480-600ml/分钟)之间范围内的流速混合mrna储备溶液。在一些实施方案中，以为或大于约5ml/分钟、10ml/分钟、15ml/分钟、20ml/分钟、25ml/分钟、30ml/分钟、35ml/分钟、40ml/分钟、45ml/分钟、50ml/分钟、60ml/分钟、80ml/分钟、100ml/分钟、200ml/分钟、300ml/分钟、400ml/分钟、500ml/分钟、或600ml/分钟的流速混合mrna储备溶液。脂质溶液根据本发明，脂质溶液含有适合于形成用于包封mrna的脂质纳米颗粒的脂质混合物。在一些实施方案中，合适的脂质溶液是基于乙醇的。例如，合适的脂质溶液可以含有溶解在纯乙醇(即，100％乙醇)中的所需脂质的混合物。在另一个实施方案中，合适的脂质溶液是基于异丙醇的。在另一个实施方案中，合适的脂质溶液是基于二甲基亚砜的。在另一个实施方案中，合适的脂质溶液是合适溶剂(包括但不限于乙醇、异丙醇和二甲基亚砜)的混合物。合适的脂质溶液可以含有各种浓度的所需脂质的混合物。例如，合适的脂质溶液可以含有总浓度为约0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml、4.0mg/ml、5.0mg/ml、6.0mg/ml、7.0mg/ml、8.0mg/ml、9.0mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、或100mg/ml的所需脂质的混合物。在一些实施方案中，合适的脂质溶液可以含有总浓度在约0.1-100mg/ml、0.5-90mg/ml、1.0-80mg/ml、1.0-70mg/ml、1.0-60mg/ml、1.0-50mg/ml、1.0-40mg/ml、1.0-30mg/ml、1.0-20mg/ml、1.0-15mg/ml、1.0-10mg/ml、1.0-9mg/ml、1.0-8mg/ml、1.0-7mg/ml、1.0-6mg/ml、或1.0-5mg/ml范围内的所需脂质的混合物。在一些实施方案中，合适的脂质溶液可以含有总浓度为最多约100mg/ml、90mg/ml、80mg/ml、70mg/ml、60mg/ml、50mg/ml、40mg/ml、30mg/ml、20mg/ml、或10mg/ml的所需脂质的混合物。任何所需脂质可以任何适合于包封mrna的比率混合。在一些实施方案中，合适的脂质溶液含有所需脂质的混合物，所述所需脂质包括阳离子脂质、辅助脂质(例如，非阳离子脂质和/或胆固醇脂质)和/或peg化的脂质。在一些实施方案中，合适的脂质溶液含有所需脂质的混合物，所述所需脂质包括一种或多种阳离子脂质、一种或多种辅助脂质(例如，非阳离子脂质和/或胆固醇脂质)和一种或多种peg化的脂质。阳离子脂质如本文所用，短语“阳离子脂质”是指在选定ph诸如生理ph下具有净正电荷的多种脂质物质中的任何一种。用于本发明的组合物和方法的合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo2010/144740中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质、(6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：及其药学上可接受的盐。用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo2013/149140中所述的可电离阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式之一的阳离子脂质：或其药学上可接受的盐，其中r1和r2各自独立地选自由以下项组成的组：氢、任选地取代的不同饱和或不饱和的c1-c20烷基和任选地取代的不同饱和或不饱和的c6-c20酰基；其中l1和l2各自独立地选自由以下项组成的组：氢、任选地取代的c1-c30烷基、任选地取代的不同不饱和的c1-c30烯基和任选地取代的c1-c30炔基；其中m和o各自独立地选自由以下项组成的组：零和任何正整数(例如，其中m为三)；并且其中n为零或任何正整数(例如，其中n为一)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(15z,18z)-n,n-二甲基-6-((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-l-基)二十四碳-15,18-二烯-1-胺(“hgt5000”)，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：(hgt-5000)及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(15z,18z)-n,n-二甲基-6-((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-4,15,18-三烯-l-胺(“hgt5001”)，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：(hgt-5001)及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质和(15z,18z)-n,n-二甲基-6-((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-5,15,18-三烯-1-胺(“hgt5002”)，所述阳离子脂质具有以下化合物结构：(hgt-5002)及其药学上可接受的盐。用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括在国际专利公开wo2010/053572中描述为氨基醇类脂质的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo2016/118725中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo2016/118724中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括具有通式14,25-二-十三烷基15,18,21,24-四氮杂-三十八烷的阳离子脂质及其药学上可接受的盐。用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo2013/063468和wo2016/205691中所述的阳离子脂质，这些专利公开中的每个以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：或其药学上可接受的盐，其中rl的每个实例独立地是任选地取代的c6-c40烯基。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo2015/184256中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：或其药学上可接受的盐，其中每个x独立地是o或s；每个y独立地是o或s；每个m独立地为0至20；每个n独立为1至6；每个ra独立地是氢、任选地取代的c1-50烷基、任选地取代的c2-50烯基、任选地取代的c2-50炔基、任选地取代的c3-10碳环基、任选地取代的3-14元杂环基、任选地取代的c6-14芳基、任选地取代的5-14元杂芳基或卤素；并且每个rb独立地是氢、任选地取代的c1-50烷基、任选地取代的c2-50烯基、任选地取代的c2-50炔基、任选地取代的c3-10碳环基、任选地取代的3-14元杂环基、任选地取代的c6-14芳基、任选地取代的5-14元杂芳基或卤素。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“靶标23”：(靶标23)及其药学上可接受的盐。用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo2016/004202中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：或其药学上可接受的盐。用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如j.mcclellan,m.c.king,cell2010,141,210-217和whitehead等人.,naturecommunications(2014)5:4277中所述的阳离子脂质，这些文献以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法的阳离子脂质包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo2015/199952中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo2017/004143中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo2017/075531中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：或其药学上可接受的盐，其中l1或l2中的一者是-o(c＝o)-、-(c＝o)o-、-c(＝o)-、-o-、-s(o)x、-s-s-、-c(＝o)s-、-sc(＝o)-、-nrac(＝o)-、-c(＝o)nra-、nrac(＝o)nra-、-oc(＝o)nra-或-nrac(＝o)o-；并且l1或l2中的另一者是-o(c＝o)-、-(c＝o)o-、-c(＝o)-、-o-、-s(o)x、-s-s-、-c(＝o)s-、sc(＝o)-、-nrac(＝o)-、-c(＝o)nra-、nrac(＝o)nra-、-oc(＝o)nra-或-nrac(＝o)o-或直接键；g1和g2各自独立地是未取代的c1-c12亚烷基或c1-c12亚烯基；g3是c1-c24亚烷基、c1-c24亚烯基、c3-c8亚环烷基、c3-c8亚环烯基；ra是h或c1-c12烷基；r1和r2各自独立地是c6-c24烷基或c6-c24烯基；r3是h、or5、cn、-c(＝o)or4、-oc(＝o)r4或-nr5c(＝o)r4；r4是c1-c12烷基；r5是h或c1-c6烷基；并且x为0、1或2。用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo2017/117528中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo2017/049245中所述的阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法的阳离子脂质包括具有下式之一的化合物：及其药学上可接受的盐。对于这四个通式中的任一者，r4独立地选自-(ch2)nq和-(ch2)nchqr；q选自由以下项组成的组-or、-oh、-o(ch2)nn(r)2、-oc(o)r、-cx3、-cn、-n(r)c(o)r、-n(h)c(o)r、-n(r)s(o)2r、-n(h)s(o)2r、-n(r)c(o)n(r)2、-n(h)c(o)n(r)2、-n(h)c(o)n(h)(r)、-n(r)c(s)n(r)2、-n(h)c(s)n(r)2、-n(h)c(s)n(h)(r)和杂环；并且n为1、2或3。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo2017/173054和wo2015/095340中所述的阳离子脂质，这些专利公开中的每个以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：及其药学上可接受的盐。用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开wo2012/170889中所述的可切割阳离子脂质，该专利公开以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：其中r1选自由以下项组成的组：咪唑、胍、氨基、亚胺、烯胺、任选地取代的烷基氨基(例如，烷基氨基，诸如二甲基氨基)和吡啶基；其中r2选自由以下两个通式之一组成的组：并且其中r3和r4各自独立地选自由以下项组成的组：任选地取代的不同饱和或不饱和的c6-c20烷基和任选地取代的不同饱和或不饱和的c6-c20酰基；并且其中n为零或任何正整数(例如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十或更多)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“hgt4001”：及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“hgt4002”：及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“hgt4003”：及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“hgt4004”：及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“hgt4005”：及其药学上可接受的盐。用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括可切割的阳离子脂质，如2018年5月16日提交的美国临时申请号62/672,194中所述，该临时申请以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质，所述阳离子脂质为美国临时申请号62/672,194中所述的通式中的任一者或者结构(1a)-(21a)和(1b)-(21b)和(22)-(237)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有根据式(i')的结构的阳离子脂质，其中：rx独立地为-h、-l1-r1或–l5a-l5b-b’；l1、l2和l3中的每个独立地为共价键、-c(o)-、-c(o)o-、-c(o)s-或-c(o)nrl-；每个l4a和l5a独立地为-c(o)-、-c(o)o-或-c(o)nrl-；每个l4b和l5b独立地为c1-c20亚烷基、c2-c20亚烯基或c2-c20亚炔基；每个b和b’为nr4r5或5元至10元含氮的杂芳基；每个r1、r2和r3独立地为c6-c30烷基、c6-c30烯基或c6-c30炔基；每个r4和r5独立地为氢、c1-c10烷基；c2-c10烯基；或c2-c10炔基；并且每个rl独立地为氢、c1-c20烷基、c2-c20烯基或c2-c20炔基。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质，所述阳离子脂质为62/672,194的化合物(139)，所述化合物具有以下化合物结构：(“18:1碳尾核糖脂质”)。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质、n-[l-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(“dotma”)。(feigner等人.proc.nat'lacad.sci.84,7413(1987)；美国专利号4,897,355，该专利以引用的方式并入本文)。适用于本发明的组合物和方法的其他阳离子脂质包括例如5-羧基精胺基甘氨酸二-十八烷基酰胺(“dogs”)；2,3-二油烯基氧基-n-[2-(精胺-羧胺)乙基]-n,n-二甲基-l-丙铵(“dospa”)(behr等人.proc.nat.'lacad.sci.86,6982(1989)，美国专利号5,171,678；美国专利号5,334,761)；l,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(“dodap”)；l,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(“dotap”)。适用于本发明的组合物和方法的附加的示例性阳离子脂质还包括：l,2-二硬脂酰氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷(“dsdma”)、1,2-二油烯基氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷(“dodma”)、1,2-二亚油基氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷(“dlindma”)、l,2-二亚油烯基氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷(“dlendma”)、n-二油烯基-n,n-二甲基氯化铵(“dodac”)、n,n-二硬脂酰基-n,n-二甲基溴化铵(“ddab”)、n-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-n,n-二甲基-n-羟乙基溴化铵(“dmrie”)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-l-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(“clindma”)、2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基-l-(顺式,顺式-9',l-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(“cplindma”)、n,n-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄胺(“dmoba”)、1,2-n,n'-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“docarbdap”)、2,3-二亚油酰氧基-n,n-二甲基丙基胺(“dlindap”)、l,2-n,n'-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“dlincarbdap”)、l,2-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“dlincdap”)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[l,3]-二氧戊环(“dlin-k-dma”)、2-((8-[(3p)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-n,n-二甲基-3-[(9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-clindma”)、(2r)-2-((8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-n,n-二甲基-3-[(9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-clindma(2r)”)、(2s)-2-((8-[(3p)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-n,fsl-二甲基3-[(9z,12z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-clindma(2s)”)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧戊环(“dlin-k-xtc2-dma”)和2-(2,2-二((9z,12z)-十八碳-9,l2-二烯-1-基)-l,3-二氧戊环-4-基)-n,n-二甲基乙胺(“dlin-kc2-dma”)(参见wo2010/042877，该专利以引用方式并入本文；semple等人，naturebiotech.28:172-176(2010))。(heyes,j.,等人.,jcontrolledrelease107:276-287(2005)；morrissey,dv.,等人.,nat.biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；国际专利公开wo2005/121348)。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包含咪唑、二烷基氨基或胍鎓部分中的至少一种。在一些实施方案中，适用于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(“xtc”)；(3ar,5s,6as)-n,n-二甲基-2,2-二((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯基)四氢-3ah-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺(“alny-100”)和/或4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-n1,n16-二-十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺(“nc98-5”)。在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以重量计占组合物(例如脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的至少约5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以摩尔％计占组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的至少约5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以重量计占组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的约30-70％(例如，约30-65％、约30-60％、约30-55％、约30-50％、约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％或约35-40％)。在一些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质以摩尔％计占组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的约30-70％(例如，约30-65％、约30-60％、约30-55％、约30-50％、约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％或约35-40％)。在一些实施方案中，作为本文所述的阳离子脂质的代替或除本文所述的阳离子脂质之外，可以使用基于甾醇的阳离子脂质。合适的基于甾醇的阳离子脂质是含二烷基氨基、咪唑和胍的基于甾醇的阳离子脂质。例如，某些实施方案涉及包含一种或多种包含咪唑的基于甾醇的阳离子脂质的组合物，所述阳离子脂质例如咪唑胆固醇酯或“ice”脂质(3s,10r,13r,17r)-10,13-二甲基-17-((r)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1h-环戊二烯并[a]菲-3-基3-(1h-咪唑-4-基)丙酸酯，如以下结构(i)所表示。在某些实施方案中，用于递送编码功能蛋白的rna(例如，mrna)的脂质纳米颗粒可以包含一种或多种基于咪唑的阳离子脂质，例如咪唑胆固醇酯或“ice”脂质(3s,10r,13r,17r)-10,13-二甲基-17-((r)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1h-环戊二烯并[a]菲-3-基3-(1h-咪唑-4-基)丙酸酯，如以下结构所表示：在一些实施方案中，脂质体中阳离子脂质的百分比可大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％或大于70％。在一些实施方案中，阳离子脂质按重量计占脂质体的约30-50％(例如，约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％、或约35-40％。在一些实施方案中，阳离子脂质(例如，ice脂质)以摩尔比计占脂质体的约30％、约35％、约40％、约45％或约50％。如本文使用的，短语“非阳离子脂质”指任何中性、两性离子或阴离子脂质。如本文使用的，短语“阴离子脂质”指在选择的ph，例如生理ph下携带净负电荷的许多脂质物质中的任一种。非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二油酰磷脂酰胆碱(dopc)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二油酰磷脂酰甘油(dopg)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(popc)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(pope)、4-(n-马来酰亚胺甲基)-环己烷-l-甲酸二油酰-磷脂酰乙醇胺(dope-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二豆蔻酰磷酸乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(dspe)、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、脑苷脂、神经节苷脂、16-o-单甲基pe、16-o-二甲基pe、18-1-反式pe、l-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(sope)、或它们的混合物。在一些实施方案中，此类非阳离子脂质可以单独使用，但是优选地与其他脂质(例如，阳离子脂质)组合使用。在一些实施方案中，非阳离子脂质可包含脂质体中存在的总脂质的约5％至约90％、或约10％至约70％的摩尔比。在一些实施方案中，非阳离子脂质是中性脂质，即在其下配制和/或施用组合物的条件下不携带净电荷的脂质。在一些实施方案中，脂质体中非阳离子脂质的百分比可大于5％、大于10％、大于20％、大于30％或大于40％。合适的基于胆固醇的阳离子脂质包括例如dc-choi(n,n-二甲基-n-乙基甲酰胺胆固醇)、l,4-双(3-n-油烯基氨基-丙基)哌嗪(gao,等人.biochem.biophys.res.comm.179,280(1991)；wolf等人.biotechniques23,139(1997)；美国专利号5,744,335)或ice。在一些实施方案中，基于胆固醇的脂质可包含脂质体中存在的总脂质的约2％至约30％、或约5％至约20％的摩尔比。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中的基于胆固醇的脂质的百分比可以为大于5％、大于10％、大于20％、大于30％或大于40％。本发明还设想了聚乙二醇(peg)修饰的磷脂和衍生化的脂质(诸如，衍生化的神经酰胺(peg-cer)，包括n-辛酰基鞘氨醇-1-[琥珀酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](c8peg-2000神经酰胺))单独或优选地与其他脂质调配物(它包含转移媒介物(例如，脂质纳米颗粒))一起组合的使用。设想的peg修饰的脂质包括但不限于长度为最多skda的聚乙二醇链，所述聚乙二醇链共价连接至具有一条或多条c6-c20长度的烷基链的脂质。此类组分的添加可以防止复合物聚集，并且还可以提供延长循环寿命和增加脂质-核酸组合物至靶组织的递送的手段(klibanov等人.(1990)febsletters,268(1):235-237)，或者可以选择它们以在体内迅速地从调配物中交换出来(参见美国专利号5,885,613)。特别有用的可交换脂质是具有较短酰基链(例如，c14或c18)的peg-神经酰胺。本发明的peg修饰的磷脂和衍生化的脂质可以包含以摩尔比计脂质体转移媒介物中存在的总脂质的约0％至约20％、约0.5％至约20％、约1％至约15％、约4％至约10％、或约2％。根据各种实施方案，包含脂质纳米颗粒的阳离子脂质、非阳离子脂质和/或peg修饰的脂质的选择，以及这些脂质与彼此的相对摩尔比基于所选择的脂质的特征、预期靶细胞的性质、待递送的mrna的特征。另外的考虑因素包括例如烷基链的饱和度，以及所选脂质的尺寸、电荷、ph、pka、融合性和毒性。因此，可相应地调节摩尔比。在一些实施方案中，使用聚合物作为载体，单独或与包括本文所述的各种脂质的其他载体组合，配制合适的递送媒介物。因此，在一些实施方案中，如本文所用，脂质体递送媒介物还涵盖包含聚合物的纳米颗粒。合适的聚合物可包括例如聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、海藻酸盐、胶原、壳聚糖、环糊精、鱼精蛋白、peg化鱼精蛋白、pll、peg化pll和聚乙烯亚胺(pei)。当存在pei时，它可为分子量范围为10至40kda的支化pei，例如25kda支化pei(sigma#408727)。用于本发明的合适的脂质体可以包含各种比率的本文所述的阳离子脂质、非阳离子脂质、胆固醇脂质、peg修饰的脂质和/或聚合物中的任一者中的一者或多者。作为非限制性实例，合适的脂质体调配物可以包含选自以下的组合：ckk-e12、dope、胆固醇和dmg-peg2k；c12-200、dope、胆固醇和dmg-peg2k；hgt4003、dope、胆固醇和dmg-peg2k；ice、dope、胆固醇和dmg-peg2k；或者ice、dope和dmg-peg2k。在多个实施方案中，阳离子脂质(例如，ckk-e12、c12-200、ice和/或hgt4003)以摩尔比计占脂质体的约30-60％(例如，约30-55％、约30-50％、约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％或约35-40％)。在一些实施方案中，阳离子脂质(例如，ckk-e12、c12-200、ice和/或hgt4003)的百分比以摩尔比计等于或大于脂质体的约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％或约60％。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种peg修饰的脂质的比率可以分别地在约30-60:25-35:20-30:1-15之间。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种peg修饰的脂质的比率分别地为大约40:30:20:10。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种peg修饰的脂质的比率分别地为大约40:30:25:5。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种peg修饰的脂质的比率分别地为大约40:32:25:3。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种peg修饰的脂质的比率为大约50:25:20:5。在一些实施方案中，一种或多种甾醇脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种peg修饰的脂质的比率为50:45:5。在一些实施方案中，一种或多种甾醇脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种peg修饰的脂质的比率为50:40:10。在一些实施方案中，一种或多种甾醇脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种peg修饰的脂质的比率为55:40:5。在一些实施方案中，一种或多种甾醇脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种peg修饰的脂质的比率为55:35:10。在一些实施方案中，一种或多种甾醇脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种peg修饰的脂质的比率为60:35:5。在一些实施方案中，一种或多种甾醇脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种peg修饰的脂质的比率为60:30:10。在一些实施方案中，用于本发明的合适的脂质体包含ice和dope的ice:dope摩尔比>1:1。在一些实施方案中，ice:dope摩尔比<2.5:1。在一些实施方案中，ice:dope摩尔比在1:1和2.5:1之间。在一些实施方案中，ice:dope摩尔比为大约1.5:1。在一些实施方案中，ice:dope摩尔比为大约1.7:1。在一些实施方案中，ice:dope摩尔比为大约2:1。在一些实施方案中，用于本发明的合适的脂质体包含ice和dmg-peg-2k的ice:dmg-peg-2k摩尔比>10:1。在一些实施方案中，ice:dmg-peg-2k摩尔比<16:1。在一些实施方案中，ice:dmg-peg-2k摩尔比为大约12:1。在一些实施方案中，ice:dmg-peg-2k摩尔比为大约14:1。在一些实施方案中，用于本发明的合适的脂质体包含dope和dmg-peg-2k的dope:dmg-peg-2k摩尔比>5:1。在一些实施方案中，dope:dmg-peg-2k摩尔比<11:1。在一些实施方案中，dope:dmg-peg-2k摩尔比为大约7:1。在一些实施方案中，dope:dmg-peg-2k摩尔比为大约10:1。在一些实施方案中，用于本发明的合适的脂质体包含ice、dope和dmg-peg-2k的ice:dope:dmg-peg-2k摩尔比为50:45:5。在一些实施方案中，用于本发明的合适的脂质体包含ice、dope和dmg-peg-2k的ice:dope:dmg-peg-2k摩尔比为50:40:10。在一些实施方案中，用于本发明的合适的脂质体包含ice、dope和dmg-peg-2k的ice:dope:dmg-peg-2k摩尔比为55:40:5。在一些实施方案中，用于本发明的合适的脂质体包含ice、dope和dmg-peg-2k的ice:dope:dmg-peg-2k摩尔比为55:35:10。在一些实施方案中，用于本发明的合适的脂质体包含ice、dope和dmg-peg-2k的ice:dope:dmg-peg-2k摩尔比为60:35:5。在一些实施方案中，用于本发明的合适的脂质体包含ice、dope和dmg-peg-2k的ice:dope:dmg-peg-2k摩尔比为60:30:10。peg化的脂质在一些实施方案中，合适的脂质溶液包含一种或多种peg化的脂质。例如，本发明还设想了聚乙二醇(peg)修饰的磷脂和衍生化的脂质(例如衍生化的神经酰胺(peg-cer)，包括n-辛酰基-鞘氨醇-l-[琥珀酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](c8peg-2000神经酰胺))的使用。设想的peg修饰的脂质包括但不限于长度为最多2kda、最多3kda、最多4kda或最多5kda的聚乙二醇链，所述聚乙二醇链共价连接至具有一条或多条c6-c20长度的烷基链的脂质。在一些实施方案中，peg修饰的或peg化的脂质是peg化的胆固醇或peg-2k。在一些实施方案中，特别有用的可交换脂质是具有较短的酰基链(例如，c14或c18)的peg-神经酰胺。在合适脂质溶液中，peg修饰的磷脂和衍生化的脂质可以按重量计或按摩尔计占总脂质的不大于约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％。在一些实施方案中，在合适的脂质溶液中，peg修饰的脂质可以按重量计或按摩尔浓度计占总脂质的约5％或更少。在一些实施方案中，在合适的脂质溶液中，peg修饰的脂质可以按重量计或按摩尔浓度计占总脂质的约4％或更少。在一些实施方案中，在合适的脂质溶液中，peg修饰的脂质通常按重量计或按摩尔浓度计占总脂质的3％或更少。在一些实施方案中，在合适的脂质溶液中，peg修饰的脂质通常按重量计或按摩尔浓度计占总脂质的2％或更少。在一些实施方案中，在合适的脂质溶液中，peg修饰的脂质通常按重量计或按摩尔浓度计占总脂质的1％或更少。在一些实施方案中，在合适的脂质溶液中，peg修饰的脂质按重量计或按摩尔浓度计占总脂质的约1-5％、约1-4％、约1-3％或约1-2％。在一些实施方案中，在合适的脂质溶液中，peg修饰的脂质按重量计或按摩尔浓度计占总脂质的约0.01-3％(例如，约0.01-2.5％、0.01-2％、0.01-1.5％、0.01-1％)。可以用于制备并包含在预先形成的脂质纳米颗粒中的各种脂质组合，即阳离子脂质、非阳离子脂质、peg-修饰的脂质和任选地胆固醇，在文献和本文中有描述。例如，合适的脂质溶液可以含有ckk-e12、dope、胆固醇和dmg-peg2k；c12-200、dope、胆固醇和dmg-peg2k；hgt5000、dope、胆固醇和dmg-peg2k；hgt5001、dope、胆固醇和dmg-peg2k；ckk-e12、dppc、胆固醇和dmg-peg2k；c12-200、dppc、胆固醇和dmg-peg2k；hgt5000、dppc、chol和dmg-peg2k；hgt5001、dppc、胆固醇和dmg-peg2k；或ice、dope和dmg-peg2k。另外的脂质组合在本领域中有描述，例如，美国序列号62/420,421(于2016年11月10日提交)、美国序列号62/421,021(于2016年11月11日提交)、美国序列号62/464,327(于2017年2月27日提交)以及于2017年11月10日提交的标题为“novelice-basedlipidnanoparticleformulationfordeliveryofmrna”的pct申请，所这些专利申请的全部公开内容以引用方式包括于本文中。包含脂质混合物的阳离子脂质、非阳离子脂质和/或peg修饰的脂质的选择以及此类脂质彼此的相对摩尔比基于一种或多种所选的脂质的特征和待包封的mrna的特征性质。另外的考虑因素包括例如烷基链的饱和度，以及所选脂质的尺寸、电荷、ph、pka、融合性和毒性。因此，可相应地调节摩尔比。预先形成的纳米颗粒调配物和混合过程本发明基于令人惊讶的发现，即以低浓度混合空的预先形成的脂质纳米颗粒(即，在不存在mrna的情况下形成的脂质纳米颗粒)和mrna可以导致有效的包封而不使脂质纳米颗粒聚集。本发明尤其可用于用含有低水平的peg修饰的脂质(例如，不大于3％、2.5％、2％、1.5％、1％、0.5％或0.1％的在lnp中的总脂质)包封mrna。不希望受到任何理论的束缚，据信含有低水平的peg修饰的脂质的脂质纳米颗粒倾向于聚集。在一些先前公开的过程中，参见于2015年7月2日提交的标题为“encapsulationofmessengerrna”的美国专利申请序列号14/790,562及其于2014年7月2日提交的临时美国专利申请序列号62/020,163(这些专利申请的公开内容据此整体并入)，在一些实施方案中，先前发明提供了通过混合mrna溶液和脂质溶液将信使rna(mrna)包封在脂质纳米颗粒中的过程，其中在混合之前将所述mrna溶液和/或所述脂质溶液加热至高于环境温度的预定温度，以形成包封mrna的脂质纳米颗粒。本发明涉及用于制备含有mrna的脂质纳米颗粒的新颖方法，所述方法涉及将预先形成的脂质纳米颗粒与mrna组合，其中所述预先形成的脂质纳米颗粒包含低peg修饰的脂质(通常为在lnp中总脂质的3％或更少)。在一些实施方案中，可以将lnp浓度降低(稀释)至1mg/ml，同时将mrna浓度降低(稀释)至约1mg/ml以避免lnp聚集并确保高包封效率。在一些实施方案中，使lnp浓度降低至约0.9mg/ml或更低、或0.8mg/ml或更低、或0.7mg/ml或更低、或0.6mg/ml或更低、或0.5mg/ml或更低、或0.4mg/ml或更低、或0.3mg/ml或更低、或0.2mg/ml或更低、或0.1mg/ml或更低、或0.05mg/ml或更低、或0.01mg/ml。在一些实施方案中，使对应的mrna浓度降低至约3mg/ml或更低、或2mg/ml或更低、或1mg/ml或更低、或0.9mg/ml或更低、或0.8mg/ml或更低、或0.7mg/ml或更低、或0.6mg/ml或更低、或0.5mg/ml或更低、或0.4mg/ml或更低、或0.3mg/ml或更低、或0.2mg/ml或更低、或0.1mg/ml或更低、或0.05mg/ml或更低、或0.01mg/ml。在一些实施方案中，包封混合物中的lnp浓度在0.05mg/ml和2mg/ml之间，并且对应的mrna浓度在0.05mg/ml和2mg/ml之间，使得lnp颗粒不聚集。在一些实施方案中，包封混合物中的示例性lnp浓度的范围在0.1mg/ml和1mg/ml之间。在一些实施方案中，mrna混合物中的示例性mrna浓度的范围在0.1mg/ml和1mg/ml之间。在一些实施方案中，在混合进行包封期间，预先形成的脂质纳米颗粒和mrna中的每一者的浓度小于1mg/ml。所得的调配颗粒具有高的效力和功效。组分的混合通过泵系统来实现，所述泵系统在整个过程中维持脂质/mrna(n/p)比率恒定，并且还能够容易地按比例放大。在一些实施方案中，所述过程是大规模执行的。例如，在一些实施方案中，根据本发明的组合物含有至少约1mg、5mg、10mg、50mg、100mg、500mg或1000mg的包封mrna。对于mrna的某些阳离子脂质纳米颗粒调配物，为了实现对于mrna的保护和递送至关重要的mrna的高度包封，必须加热柠檬酸盐缓冲液中的mrna。在那些过程或方法中，需要在调配过程之前进行加热(即加热单独的组分)，因为加热后调配物(纳米颗粒的后形成)不会增加脂质纳米颗粒中mrna的包封效率。相反，在本发明新颖方法的一些实施方案中，加热mrna的顺序似乎不影响mrna的包封百分比。在一些实施方案中，在调配过程之前或之后，不需要进行对包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含mrna的溶液和包含脂质纳米颗粒包封的mrna的混合溶液中的一种或多种加热(即，维持在环境温度)。这可能为精确按比例增加提供巨大优势，因为易于实现混合后温度变化的控制。使用这种新颖方法，在一些实施方案中，与通过将mrna仅与脂质组分(即，未预先形成为脂质纳米颗粒的脂质组分)混合来包封mrna(过程a)相比，通过将mrna与空的(即，不含mrna的)预先形成的脂质纳米颗粒混合来包封mrna(过程b)产生了显著更高的效力。如下面实施例中所描述，例如在表3和表4中，与过程a相比，当通过过程b制备时，所测试的任何包封mrna的脂质纳米颗粒的效力具有超过100％至超过1000％更高的效力。在一些实施方案中，通过混合在溶剂中含有溶解的脂质的脂质溶液和水性/缓冲溶液来形成没有mrna的空的(即，不含mrna的)脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，溶剂可以是乙醇。在一些实施方案中，水性溶液可以是柠檬酸盐缓冲液。如本文所用，术语“环境温度”是指无需加热或冷却的房间温度或在所关注对象(例如，预先形成的空的脂质纳米颗粒溶液、mrna溶液或含有mrna的脂质纳米颗粒溶液)周围的温度。在一些实施方案中，一种或多种溶液所维持的环境温度为或小于约35℃、30℃、25℃、20℃或16℃。在一些实施方案中，一种或多种溶液所述维持的环境温度在约15-35℃、约15-30℃、约15-25℃、约15-20℃、约20-35℃、约25-35℃、约30-35℃、约20-30℃、约25-30℃或约20-25℃的范围内。在一些实施方案中，一种或多种溶液所维持的环境温度为20-25℃。因此，高于环境温度的预定温度通常大于约25℃。在一些实施方案中，适合于本发明的预定温度为或大于约30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃。在一些实施方案中，适合于本发明的预定温度在约25-70℃、约30-70℃、约35-70℃、约40-70℃、约45-70℃、约50-70℃、或约60-70℃。在特定实施方案中，适合于本发明的预定温度为约65℃。在一些实施方案中，在混合之前可以将mrna溶液或预先形成的空的(即，不含mrna的)脂质纳米颗粒溶液或两者加热至高于环境温度的预定温度。在一些实施方案中，在混合之前将mrna溶液和预先形成的空的脂质纳米颗粒溶液分别加热至预定温度。在一些实施方案中，将mrna溶液和预先形成的空的脂质纳米颗粒溶液在环境温度下混合，而然后在混合之后加热至预定温度。在一些实施方案中，将预先形成的空的脂质纳米颗粒溶液加热至预定温度并在环境温度下与mrna混合。在一些实施方案中，将mrna溶液加热至预定温度，并在环境温度下与预先形成的空的脂质纳米颗粒溶液混合。在一些实施方案中，通过将在环境温度下的mrna储备溶液添加至加热的缓冲溶液中以达到所需的预定温度来将mrna溶液加热至预定温度。在一些实施方案中，可以在混合之前将含有溶解的脂质的脂质溶液、或水性/缓冲溶液、或两者加热至高于环境温度的预定温度。在一些实施方案中，在混合之前将含有溶解的脂质的脂质溶液和水性溶液分别加热至预定温度。在一些实施方案中，将含有溶解的脂质的脂质溶液和水性溶液在环境温度下混合，而然后在混合之后加热至预定温度。在一些实施方案中，将含有溶解的脂质的脂质溶液加热至预定温度，并且在环境温度下与水性溶液混合。在一些实施方案中，将水性溶液加热至预定温度并且在环境温度下与含有溶解的脂质的脂质溶液混合。在一些实施方案中，在调配过程之前或之后，不进行对包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含mrna的溶液和包含脂质纳米颗粒包封的mrna的混合溶液中的一种或多种加热。在一些实施方案中，可以使用泵将脂质溶液和水性或缓冲溶液混合。在一些实施方案中，可以使用泵将mrna溶液和预先形成的空的脂质纳米颗粒溶液混合。由于包封程序可以在各种规模上进行，因此可以使用不同类型的泵来适应所需的规模。然而，通常期望使用无脉冲流量泵。如本文所用，无脉冲流量泵是指能够以稳定的流速建立连续流量的任何泵。合适的泵的类型可以包括但不限于齿轮泵和离心泵。示例性齿轮泵包括但不限于cole-parmer或diener齿轮泵。示例性离心泵包括但不限于由grainger或cole-parmer制造的那些。可以以各种流速混合mrna溶液和预先形成的空的脂质纳米颗粒溶液。通常，可以以比脂质溶液的流速更大的流速混合mrna溶液。例如，可以以比脂质溶液的流速大至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍的流速混合mrna储液。可以基于规模确定用于混合的合适的流速。在一些实施方案中，以在约40-400ml/分钟、60-500ml/分钟、70-600ml/分钟、80-700ml/分钟、90-800ml/分钟、100-900ml/分钟、110-1000ml/分钟、120-1100ml/分钟、130-1200ml/分钟、140-1300ml/分钟、150-1400ml/分钟、160-1500ml/分钟、170-1600ml/分钟、180-1700ml/分钟、150-250ml/分钟、250-500ml/分钟、500-1000ml/分钟、1000-2000ml/分钟、2000-3000ml/分钟、3000-4000ml/分钟、或4000-5000ml/分钟范围内的流速混合mrna溶液。在一些实施方案中，以约200ml/分钟、约500ml/分钟、约1000ml/分钟、约2000ml/分钟、约3000ml/分钟、约4000ml/分钟、或约5000ml/分钟的流速混合mrna溶液。在一些实施方案中，以在约25-75ml/分钟、20-50ml/分钟、25-75ml/分钟、30-90ml/分钟、40-100ml/分钟、50-110ml/分钟、75-200ml/分钟、200-350ml/分钟、350-500ml/分钟、500-650ml/分钟、650-850ml/分钟、或850-1000ml/分钟范围内的流速混合脂质溶液或预先形成的脂质纳米颗粒溶液。在一些实施方案中，以约50ml/分钟、约100ml/分钟、约150ml/分钟、约200ml/分钟、约250ml/分钟、约300ml/分钟、约350ml/分钟、约400ml/分钟、约450ml/分钟、约500ml/分钟、约550ml/分钟、约600ml/分钟、约650ml/分钟、约700ml/分钟、约750ml/分钟、约800ml/分钟、约850ml/分钟、约900ml/分钟、约950ml/分钟、或约1000ml/分钟的流速混合脂质溶液。通常，在一些实施方案中，将含有溶解的脂质的脂质溶液和水性或缓冲溶液混合到溶液中，使得脂质可以形成没有mrna的纳米颗粒(或空的预先形成的脂质纳米颗粒)。在一些实施方案中，将mrna溶液和预先形成的脂质纳米颗粒溶液混合到溶液中，使得mrna变成被包封在脂质纳米颗粒中。这种溶液也被称为调配物或包封溶液。合适的调配物或包封溶液包括溶剂，诸如乙醇。例如，合适的调配物或包封溶液包括约10％乙醇、约15％乙醇、约20％乙醇、约25％乙醇、约30％乙醇、约35％乙醇或约40％乙醇。在一些实施方案中，合适的调配物或包封溶液包括溶剂，诸如异丙醇。例如，合适的调配物或包封溶液包括约10％异丙醇、约15％异丙醇、约20％异丙醇、约25％异丙醇、约30％异丙醇、约35％异丙醇或约40％异丙醇。在一些实施方案中，合适的调配物或包封溶液包括溶剂，诸如二甲基亚砜。例如，合适的调配物或包封溶液包括约10％二甲基亚砜、约15％二甲基亚砜、约20％二甲基亚砜、约25％二甲基亚砜、约30％二甲基亚砜、约35％二甲基亚砜或约40％二甲基亚砜。在一些实施方案中，合适的调配物或包封溶液也可以含有缓冲剂或盐。示例性的缓冲剂可以包括hepes、硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾和磷酸钠。示例性的盐可以包括氯化钠、氯化镁和氯化钾。在一些实施方案中，可以将用于制备这种新型纳米颗粒调配物的空的预先形成的脂质纳米颗粒调配物在10％海藻糖溶液中稳定地冷冻。在一些实施方案中，可以将用于制备这种新型纳米颗粒调配物的空的(即，不含mrna的)预先形成的脂质纳米颗粒调配物在约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％的海藻糖溶液中稳定地冷冻。在一些实施方案中，将mrna添加至空的脂质纳米颗粒中可以产生不需要任何下游纯化或加工并且可以以冷冻形式稳定地储存的最终调配物。在一些实施方案中，在添加mrna期间不存在乙醇、柠檬酸盐缓冲液和其他去稳定剂，并且因此所述调配物不需要任何进一步的下游加工。在一些实施方案中，通过此新颖方法制备的脂质纳米颗粒调配物由海藻糖溶液中的预先形成的脂质纳米颗粒组成。缺乏去稳定剂和海藻糖溶液的稳定性增加了按比例增加调配物和生产包封mrna的脂质纳米颗粒的容易度。纯化在一些实施方案中，纯化和/或浓缩空的预先形成的脂质纳米颗粒或含有mrna的脂质纳米颗粒。可以使用各种纯化方法。在一些实施方案中，使用切向流过滤来纯化脂质纳米颗粒。切向流过滤(tff)(也被称为交叉流过滤)是其中待过滤的材料切向地穿过过滤器而不是通过过滤器的一种过滤类型。在tff中，非所需渗透物穿过过滤器，而所需渗余物沿着过滤器传递且在下游收集。重要的是，应注意，所需材料通常包含在tff中的渗余物中，其与传统的死端过滤中通常遇到的情况相反。取决于待过滤的材料，tff通常用于微过滤或超过滤。微过滤通常被定义为过滤器具有0.05μm与1.0μm之间的孔尺寸的情况，而超过滤通常包括孔尺寸小于0.05μm的过滤器。孔尺寸还确定标称分子量限值(nmwl)，其也称为特定过滤器的分子量截止(mwco)，其中微过滤膜通常具有大于1,000千道尔顿(kda)的nmwl且超过滤过滤器具有1kda与1,000kda之间的nmwl。切向流过滤的主要优点是，在传统的“死端”过滤期间可能聚集在过滤器中并阻塞过滤器的非渗透性颗粒(有时被称为“滤饼”)代替地沿着过滤器表面转移。此优点允许在需要连续操作的工业过程中广泛使用切向流过滤，这是因为停机时间显著减小，因为过滤器通常不需要被移除和清洁。切向流过滤可用于包括浓缩和渗滤等的若干目的。浓缩是借以从溶液中去除溶剂，同时保留溶质分子的过程。为了有效地浓缩样品，使用具有基本上低于待保留的溶质分子的分子量的nmwl或mwco的膜。一般来说，技术人员可选择具有低于靶分子的分子量三至六倍的nmwl或mwco的过滤器。渗滤是分馏过程，其中小的非所需颗粒穿过过滤器，同时将较大的所需纳米颗粒维持在渗余物中，而不改变那些纳米颗粒的在溶液中的浓度。渗滤通常用于从溶液中去除盐或反应缓冲液。渗滤可以是连续的或不连续的。在连续渗滤中，以与产生滤液相同的速率将渗滤溶液添加到样品进料中。在不连续渗滤中，首先稀释溶液并且接着浓缩回起始浓度。可以重复不连续渗滤，直到达到纳米颗粒的所需浓度。纯化和/或浓缩的脂质纳米颗粒可以在所需缓冲液(例如pbs)中配制。提供包封mrna的纳米颗粒根据本发明的方法导致更高的效力和功效，从而允许更低的剂量，从而使治疗指数朝着积极的方向转移。在一些实施方案中，与现有技术方法相比，根据本发明的方法导致均匀且小的粒径(例如，小于150nm)，以及显著改善的包封效率和/或mrna回收率。因此，本发明提供包含本文所述的纯化纳米颗粒的组合物。组合物中大多数的纯化纳米颗粒(即大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的纯化纳米颗粒)具有约150nm(例如，约145nm、约140nm、约135nm、约130nm、约125nm、约120nm、约115nm、约110nm、约105nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、或约80nm)的尺寸。在一些实施方案中，基本上所有的纯化纳米颗粒都具有约150nm(例如，约145nm、约140nm、约135nm、约130nm、约125nm、约120nm、约115nm、约110nm、约105nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、或约80nm)的尺寸。另外，通过本发明的方法获得了具有窄的粒径范围的更均匀的纳米颗粒。例如，在本发明提供的组合物中，大于约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的纯化纳米颗粒具有在约75-150nm(例如，约75-145nm、约75-140nm、约75-135nm、约75-130nm、约75-125nm、约75-120nm、约75-115nm、约75-110nm、约75-105nm、约75-100nm、约75-95nm、约75-90nm、或75-85nm)范围内的尺寸。在一些实施方案中，基本上所有的纯化纳米颗粒具有在约75-150nm(例如，约75-145nm、约75-140nm、约75-135nm、约75-130nm、约75-125nm、约75-120nm、约75-115nm、约75-110nm、约75-105nm、约75-100nm、约75-95nm、约75-90nm、或75-85nm)范围内的尺寸。在一些实施方案中，本发明提供的组合物中的纳米颗粒的分散度或分子尺寸异质性量度(pdi)为小于约0.23(例如，小于约0.23、0.22、0.21、0.20、0.19、0.18、0.17、0.16、0.15、0.14、0.13、0.12、0.11、0.10、0.09或0.08)。在特定实施方案中，pdi为小于约0.16。在一些实施方案中，由本发明提供的组合物中超过约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的纯化脂质纳米颗粒囊封每个单独的颗粒内的mrna。在一些实施方案中，组合物中的基本上所有的纯化脂质纳米颗粒在每个单独的颗粒内囊封mrna。在一些实施方案中，根据本发明的组合物含有至少约1mg、5mg、10mg、100mg、500mg或1000mg的囊封mrna。在一些实施方案中，根据本发明的方法导致回收超过约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的mrna。在一些实施方案中，调配根据本发明的组合物以便将剂量施用至受试者。在一些实施方案中，以小于1.0mg/kgmrna脂质纳米颗粒(例如，0.6mg/kg、0.5mg/kg、0.3mg/kg、0.016mg/kg、0.05mg/kg、和0.016mg/kg)的剂量浓度调配如本文所述的mrna脂质纳米颗粒的组合物。在一些实施方案中，由于出乎意料的发现，即更低的剂量产生高的效力和功效，因此降低了剂量。在一些实施方案中，将剂量降低了约70％、65％、60％、55％、50％、45％或40％。在一些实施方案中，与过程a相比，通过过程b生产的包封mrna的脂质纳米颗粒的效力具有超过100％(即，超过200％、超过300％、超过400％、超过500％、超过600％、超过700％、超过800％、或超过900％)至超过1000％更多的效力。因此，在某些实施方案中，本发明提供了用于生产包含编码肽或多肽的纯化mrna的治疗组合物的方法，所述治疗组合物用于递送至或治疗人类受试者。在一些实施方案中，包含纯化mrna的治疗组合物用于递送至受试者肺部或肺细胞中。在某些实施方案中，本发明提供了用于生产治疗组合物的方法，所述治疗组合物包含编码在受试者中可能是缺陷的或无功能的内源蛋白的纯化mrna。在某些实施方案中，本发明提供了用于生产治疗组合物的方法，所述治疗组合物包含编码在受试者中可能是缺陷的或无功能的内源蛋白的纯化mrna。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mrna的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的肺或肺细胞。在某些实施方案中，本发明可用于制备编码囊性纤维化跨膜传导调节因子cftr的mrna的方法。cftrmrna被递送至需要用于治疗囊性纤维化的治疗组合物的受试者的肺部。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mrna的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的肝脏或肝细胞。此类肽和多肽可包括与尿素循环紊乱相关的、与溶酶体贮积紊乱相关的、与糖原贮积紊乱相关的、与氨基酸代谢紊乱相关的、与脂质代谢或纤维化紊乱相关的、与甲基丙二酸血症相关或与任何其他代谢紊乱相关的那些，对于所述代谢紊乱，以富集的全长mrna递送至或治疗肝脏或肝细胞提供治疗有益效果。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码与尿素循环障碍相关的蛋白质的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码精氨琥珀酸合成酶1蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码氨基甲酰磷酸合成酶i蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码精氨琥珀酸裂合酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码精氨酸酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码与溶酶体贮积症相关的蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码α半乳糖苷酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码葡萄糖脑苷脂酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码异氰酸酯-2-硫酸酯酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码艾杜糖苷酸酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码n-乙酰基-α-d-葡糖胺苷酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码乙酰肝素n-硫酸酯酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码半乳糖胺-6硫酸酯酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码β-半乳糖苷酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码溶酶体脂肪酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于生产治疗组合物的方法，所述治疗组合物包含编码芳基硫酸酯酶b(n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶)蛋白的纯化mrna。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码转录因子eb(tfeb)的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码与糖原贮积症相关的蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码酸性α-葡糖苷酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码葡萄糖-6-磷酸酶(g6pc)蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肝糖原磷酸化酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肌肉磷酸甘油酸突变酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码糖原解支化酶的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码与氨基酸代谢相关的蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码苯丙氨酸羟化酶的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码戊二酰-coa脱氢酶的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码丙酰基-coa羧化酶的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码草酸酶丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码与脂质代谢或纤维化疾病相关的蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码mtor抑制剂的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码atpase磷脂转运8b1(atp8b1)蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码一种或多种nf-κb抑制剂的纯化mrna的治疗组合物的方法，所述抑制剂诸如i-κbα、干扰素相关的发育调节剂1(ifrd1)和sirtuin1(sirt1)中的一种或多种。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码ppar-γ蛋白或活性变体的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码与甲基丙二酸血症相关的蛋白质的纯化mrna的治疗组合物的方法。例如，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码甲基丙二酰辅酶a突变酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码甲基丙二酰辅酶a差向异构酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含纯化mrna的治疗组合物的方法，对于该治疗组合物，递送至或治疗肝脏可以提供治疗有益效果。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码atp7b蛋白(也被称为wilson病蛋白)的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码胆色素原脱氨酶的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码一种或多种凝结酶的纯化mrna的治疗组合物的方法，所述凝结酶诸如因子viii、因子ix、因子vii和因子x。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码人血色素沉着病(hfe)蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mrna的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的心血管系统或心血管细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码血管内皮生长因子a蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码松弛素蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码骨形态发生蛋白9蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码骨形态发生蛋白2受体蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mrna的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的肌肉或肌肉细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肌营养不良蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码人源线粒体蛋白(frataxin)的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mrna的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的心肌或心肌细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码调节肌肉组织或肌肉细胞中钾通道和钠通道中的一者或两者的蛋白质的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码调节肌肉组织或肌肉细胞中kv7.1通道的蛋白质的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码调节肌肉组织或肌肉细胞中nav1.5通道的蛋白质的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mrna的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的神经系统或神经系统细胞。例如，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码存活运动神经元1蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。例如，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码存活运动神经元2蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码人源线粒体蛋白(frataxin)的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码atp结合盒亚家族d成员1(abcd1)蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码cln3蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mrna的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的血液或骨髓或者血细胞或骨髓细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码β球蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码布鲁顿酪氨酸激酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码一种或多种凝结酶的纯化mrna的治疗组合物的方法，所述凝结酶诸如因子viii、因子ix、因子vii和因子x。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mrna的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的肾脏或肾脏细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码iv型胶原α5链(col4a5)蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mrna的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于递送至或治疗受试者的眼或眼细胞。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码atp结合盒亚家族a成员4(abca4)蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码视黄醛壳素蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码视网膜色素上皮特异性65kda(rpe65)蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码290kda的中心体蛋白(cep290)的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码肽或多肽的纯化mrna的治疗组合物的方法，该治疗组合物用于向受试者或受试者的细胞递送疫苗或用疫苗治疗。例如，在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自诸如病毒之类的传染源的抗原的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自流感病毒的抗原的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自呼吸道合胞病毒的抗原的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自狂犬病病毒的抗原的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自巨细胞病毒的抗原的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自轮状病毒的抗原的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自肝炎病毒的抗原的纯化mrna的治疗组合物的方法，所述肝炎病毒诸如甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自人乳头瘤病毒的抗原的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自单纯疱疹病毒的抗原的纯化mrna的治疗组合物的方法，所述单纯疱疹病毒诸如单纯疱疹病毒1或单纯疱疹病毒2。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自人免疫缺陷病毒的抗原的纯化mrna的治疗组合物的方法，所述人免疫缺陷病毒诸如人免疫缺陷病毒1型或人免疫缺陷病毒2型。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自人间质肺炎病毒的抗原的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自人副流感病毒的抗原的纯化mrna的治疗组合物的方法，所述人副流感病毒诸如人副流感病毒1型、人副流感病毒2型或人副流感病毒3型。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自疟疾病毒的抗原的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自寨卡病毒的抗原的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码来自基孔肯雅病毒的抗原的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含纯化mrna的治疗组合物的方法，该mrna编码与受试者的癌症相关的抗原或从受试者的癌细胞中鉴定的抗原。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含纯化mrna的治疗组合物的方法，该mrna编码从受试者自身的癌细胞确定的抗原，即提供个性化的癌症疫苗。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含纯化mrna的治疗组合物的方法，该mrna编码从突变kras基因表达的抗原。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码抗体的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，抗体可以是双特异性抗体。在某些实施方案中，抗体可以是融合蛋白的一部分。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码针对ox40的抗体的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码针对vegf的抗体的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码针对组织坏死因子α的抗体的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码针对cd3的抗体的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码针对cd19的抗体的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码免疫调节剂的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码白介素12的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码白介素23的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码白介素36γ的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含纯化mrna的治疗组合物的方法，该mrna编码一种或多种干扰素基因(sting)蛋白刺激物的组成型活性变体。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码核酸内切酶的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含纯化mrna的治疗组合物的方法，该mrna编码rna指导的dna核酸内切酶蛋白，诸如cas9蛋白。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码大范围核酸酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码转录激活因子样效应子核酸酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于制备包含编码锌指核酸酶蛋白的纯化mrna的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了用于生产治疗组合物的方法，所述治疗组合物包含编码用于治疗眼睛疾病的纯化mrna。在一些实施方案中，所述方法用于生产包含编码视网膜劈裂蛋白的纯化mrna的治疗组合物。实施例虽然已根据某些实施例特异性地描述了本发明的某些化合物、组合物和方法，但以下实例仅用于说明本发明，且不打算对其进行限制。虽然已根据某些实施例特异性地描述了本发明的某些化合物、组合物和方法，但以下实例仅用于说明本发明，且不打算对其进行限制。材料除非另外指明，否则以下实施例中所述的脂质纳米颗粒调配物含有不同比率的多组分脂质混合物，所述脂质混合物采用一种或多种阳离子脂质、辅助脂质(例如，非阳离子脂质和/或胆固醇脂质)和peg化的脂质，它们被设计为包封各种核酸材料，如先前所讨论的。在以下实施例中所描述的mrna是编码萤火虫萤光素酶(ffl-mrna)或促红细胞生成素(epo-mrna)的mrna。实施例1.使用低浓度的脂质纳米颗粒和/或mrna将mrna包封在具有低peg-脂质的脂质纳米颗粒#1中本实施例说明了对用于将mrna包封在具有低摩尔％的peg-脂质的脂质纳米颗粒中的过程b的改进。如本文所用，过程b是指通过将预先形成的脂质纳米颗粒与mrna混合来包封信使rna(mrna)的过程，如在美国公开专利申请号us2018153822中进一步描述的，所述专利用于所有目的以引用方式并入本文。在过程b中可以采用一系列不同的条件，诸如变化的温度(即，加热或不加热混合物)、缓冲液和浓度。在本实施例和其他实施例中描述的示例性条件仅用于说明目的。简而言之，根据在美国公开专利申请号us2018153822中所描述的过程b，将下面表1中所述的脂质溶解于乙醇和柠檬酸盐缓冲液中，并首先在不存在mrna的情况下以表1中所述的摩尔百分比混合在一起。两股流的瞬时混合导致空脂质纳米颗粒的形成，这是一个自组装过程。所得的调配物在含有醇的柠檬酸盐缓冲液中提供了空的脂质纳米颗粒，将其进行缓冲液交换(例如，通过切向流过滤(tff))以在10％wt/体积海藻糖溶液缓冲液中提供空的脂质纳米颗粒。表1脂质摩尔％ccbene50dmg-peg1.5dspc10胆固醇38.5按照过程b，然后将所得的预先形成的空的脂质纳米颗粒的悬浮液与mrna的悬浮液混合。用预先形成的空的脂质纳米颗粒悬浮液和mrna悬浮液各自以相同的体积和以0.5mg/ml的相同浓度进行混合。然而，这种混合导致混合物中大量沉淀，这在脂质纳米颗粒中peg-脂质的百分比较高(例如高于3％)时通常不被观察到。令人惊讶的是，当将相同的预先形成的空的脂质纳米颗粒悬浮液(如表1中所述)和相同的mrna悬浮液然后各自以相同体积但各自以较低浓度混合时，未观察到沉淀。特别地，当将相同的预先形成的空的脂质纳米颗粒悬浮液(如表1中所述)和相同的mrna悬浮液各自以相同的体积但各自以0.1mg/ml混合在一起时，未观察到沉淀，并且此外，所得的mrna-脂质纳米颗粒调配物包括了其他所需的特征(平均颗粒直径＝139nm，多分散性指数(pdi)＝0.068，并且mrna包封％＝90％)。此外，当将相同的预先形成的空的脂质纳米颗粒悬浮液(如表1中所述)和相同的mrna悬浮液各自以相同的体积但各自以0.05mg/ml的甚至更低的浓度混合在一起时，未观察到沉淀，并且所得的mrna-脂质纳米颗粒调配物具有平均颗粒直径＝123nm，pdi＝0.091，并且mrna包封％＝91％)。实施例2.使用低浓度的脂质纳米颗粒和/或mrna将mrna包封在具有低peg-脂质的脂质纳米颗粒#2中本实施例是对用于将mrna包封在具有低摩尔％的peg-脂质的脂质纳米颗粒中的过程b的改进的另一说明，其中在过程b中使用较低浓度的脂质纳米颗粒和mrna解决了对于包含低摩尔百分比的peg-脂质的脂质纳米颗粒所观察到的沉淀。在本实施例中，根据过程b和如上面实施例1中所述，将下面表2中所述的脂质溶解于乙醇和柠檬酸盐缓冲液中，并且首先在不存在mrna的情况下以表2中所述的摩尔百分比混合在一起，然后进行缓冲液交换。表2脂质摩尔％target2340dmg-peg3dope30胆固醇27按照过程b，然后将所得的预先形成的空的脂质纳米颗粒的悬浮液与mrna的悬浮液混合。用预先形成的空的脂质纳米颗粒悬浮液和mrna悬浮液各自以相同的体积和各自以0.3mg/ml的相同浓度进行混合。然而，这种混合导致混合物中大量沉淀，这在脂质纳米颗粒中peg-脂质的百分比较高时通常不被观察到。令人惊讶的是，当将相同的预先形成的空的脂质纳米颗粒悬浮液(如表2中所述)和相同的mrna悬浮液然后各自以相同体积但各自以较低浓度混合时，未观察到沉淀。特别地，当将相同的预先形成的空的脂质纳米颗粒悬浮液(如表2中所述)和相同的mrna悬浮液各自以相同的体积但各自以0.1mg/ml混合在一起时，未观察到沉淀，并且此外，所得的mrna-脂质纳米颗粒调配物包括了所需的特征(平均颗粒直径＝92nm，pdi＝0.105，并且mrna包封％＝96％)。此外，当将相同的预先形成的空的脂质纳米颗粒悬浮液(如表2中所述)和相同的mrna悬浮液各自以相同的体积但各自以0.05mg/ml的甚至更低的浓度混合在一起时，未观察到沉淀，并且所得的mrna-脂质纳米颗粒调配物具有平均颗粒直径＝92nm，pdi＝0.127，并且mrna包封％＝95％)。实施例3.使用低浓度的脂质纳米颗粒和/或mrna将mrna包封在具有低peg-脂质的脂质纳米颗粒#3中本实施例是对用于将mrna包封在具有低摩尔％的peg-脂质的脂质纳米颗粒中的过程b的改进的另一说明，其中在过程b中使用较低浓度的脂质纳米颗粒和mrna解决了对于包含低摩尔百分比的peg-脂质的脂质纳米颗粒所观察到的沉淀。在本实施例中，根据过程b和如上面实施例1中所述，将下面表3中所述的脂质溶解于乙醇和柠檬酸盐缓冲液中，并且首先在不存在mrna的情况下以表3中所述的摩尔百分比混合在一起，然后进行缓冲液交换。表3脂质摩尔％ml750dmg-peg1.5dope10胆固醇38.5按照过程b，然后将所得的预先形成的空的脂质纳米颗粒的悬浮液与mrna的悬浮液混合。用预先形成的空的脂质纳米颗粒悬浮液和mrna悬浮液各自以相同的体积和各自以1.0mg/ml的相同浓度进行混合。然而，这种混合导致混合物中大量沉淀，这在脂质纳米颗粒中peg-脂质的百分比较高时通常不被观察到。令人惊讶的是，当将相同的预先形成的空的脂质纳米颗粒悬浮液(如表3中所述)和相同的mrna悬浮液然后各自以相同体积但各自以较低浓度混合时，未观察到沉淀。特别地，当将相同的预先形成的空的脂质纳米颗粒悬浮液(如表3中所述)和相同的mrna悬浮液各自以相同的体积但各自以0.01mg/ml的更低浓度混合在一起时，未观察到沉淀，并且所得的mrna-脂质纳米颗粒调配物具有平均颗粒直径＝163nm。实施例4.使用低浓度的脂质纳米颗粒和/或mrna将mrna包封在脂质纳米颗粒#4中本实施例是对用于将mrna包封在脂质纳米颗粒中的过程b的改进的另一说明，其中在过程b中使用较低浓度的脂质纳米颗粒和mrna在所得的mrna-脂质纳米颗粒调配物中提供较小的脂质纳米颗粒尺寸。在本实施例中，根据过程b和如上面实施例1中所述，将下面表4中所述的脂质溶解于乙醇和柠檬酸盐缓冲液中，并且首先在不存在mrna的情况下以表4中所述的摩尔百分比混合在一起，然后进行缓冲液交换。表4脂质摩尔％ml750dmg-peg2.5dspc10胆固醇37.5按照过程b，然后将所得的预先形成的空的脂质纳米颗粒的悬浮液与mrna的悬浮液混合。用预先形成的空的脂质纳米颗粒悬浮液和mrna悬浮液各自以相同的体积和各自以1.0mg/ml的相同浓度进行混合。在本实施例中，这种混合没有导致混合物中的大量沉淀，但是所得的mrna-脂质纳米颗粒调配物中脂质纳米颗粒的平均直径相对较大，为152nm，并且包封％为92％。然而，令人惊讶的是，当将相同的预先形成的空的脂质纳米颗粒悬浮液(如表4中所述)和相同的mrna悬浮液各自以相同的体积但各自以更低的浓度混合时，在所得的mrna-脂质纳米颗粒调配物中的脂质纳米颗粒的平均直径更小。特别地，当将相同的预先形成的空的脂质纳米颗粒悬浮液(如表4中所述)和相同的mrna悬浮液各自以相同的体积但各自以0.1mg/ml的更低浓度混合在一起时，所得的mrna-脂质纳米颗粒调配物具有133nm的更小的平均颗粒直径，并且mrna包封％＝85％)。综上所述，这些实施例中的这些数据表明，当使用如本文所述的和在美国公开专利申请号us2018153822中所述的过程b包封方法时，降低脂质纳米颗粒和/或mrna的浓度可能具有实质性的优势。这些优点包括当使用具有低摩尔百分比的peg脂质的脂质纳米颗粒时防止或避免沉淀或聚集。优势还包括在所得的mrna-脂质纳米颗粒调配物中提供较小的脂质纳米颗粒尺寸。等效物本领域的技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定本文所描述的本发明的具体实施例的许多等效物。本发明的范围并非旨在限于以上说明书，而是如以下权利要求书中所述。序列表<110>川斯勒佰尔公司<120>制备负载mrna的脂质纳米颗粒的改进方法<130>mrt-2030wo<150>62/724,582<151>2018-08-29<150>62/725,765<151>2018-08-31<160>5<170>patentin版本3.5<210>1<211>1065<212>rna<213>人工序列<220><223>合成的多核苷酸<400>1augcuguucaaccuucggaucuugcugaacaacgcugcguuccggaauggucacaacuuc60augguccggaacuucagaugcggccagccgcuccagaacaaggugcagcucaaggggagg120gaccuccucacccugaaaaacuucaccggagaag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