疫苗组合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及含猪伪狂犬病毒抗原的疫苗组合物 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由疱瘆病毒科（Herpesviridae)a亚科中的猪 疱瘆病毒I型（Suidherpesviruslstrain)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动 物的一种以发热、奇痒（除猪外）及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国 广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流产、死 胎或木乃伊胎和仔猪出现神经症状、麻痹，死亡率高。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜性及潜 伏感染特性，在外周神经系统可以长期潜伏感染，当潜伏病毒被激活变成有感染力的病毒， 被潜伏感染的宿主就会发病。
[0003] 最近的研宄报道称猪伪狂犬病发生了新的特点，突出表现为任何年龄的猪都会 感染，可在猪群水平传播，潜伏期短（1?2天），发病率在10 %?100%之间，发病猪死 亡率在10%?100 %之间（仔猪死亡率可高达100% )，感染后可引起猪只高热（40? 42°C，持续3日以上），呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐， 侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪 流产（高达35%)，早产，死胎，弱仔（弱仔14日龄前全部死亡）等繁殖障碍症状。现有 技术的疫苗免疫猪只后不能完全抵抗野毒攻击，依然会出现高热，精神沉郁，食欲下降或 废绝等症状，感染率超过80%，发病率超过30%，死亡率在10 %?20%之间。（参见彭金 美等，猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析，中国预防兽医学报，2013， 35(1) :1-4;童武等，免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定，中国动物传染病学报， 2013, 21(3) :1-7；Yuetal.,PathogenicPseudorabiesVirus,China, 2012,Emerging infectiousDiseases,2014, 20(1):102-104；Anetal. ,Pseudorabiesvirusvariant inBartha-K61-vaccinatedpigs,China,EmerginginfectiousDiseases, 2013. 19(11)： 1749-1755)，现有技术还没有疫苗能够解决针对猪伪狂犬变异株引起的伪狂犬病。
[0004] 中国专利申请CN103923884A公开了一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合 物及其制备方法和应用公开了缺失gE基因的猪伪狂犬HN1201株（CCTCCN0.V201311)，其 攻毒能提供100%保护，但攻毒后还有2-3天的一过性发热。
[0005] 目前商品化的猪伪狂犬灭活疫苗还存在有偶发性过敏情况（刘玉新等，仔猪伪狂 犬病免疫过敏反应的诊治，河南畜牧兽医，2002 (23) 2)
[0006] 目前存在的技术问题是需要更有效、更安全、更纯净的猪伪狂犬病疫苗，尤其需要 的是针对伪狂犬变异株的标记纯化灭活疫苗。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术的不足，本发明要解决的第一个问题是提供一种纯化的猪伪狂 犬病毒抗原的方法，使用该方法可以制备更有效、更安全、更纯净的猪伪狂犬病疫苗组合 物。
[0008] 本发明的第一方面在于提供一种制备疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括： (1)制备含有猪伪狂犬病毒的液体；(2)通过向所述步骤（1)的液体中加入非离子表面活 性剂或者含有非离子表面活性剂的溶液，增溶存在于猪伪狂犬病毒液体中的囊膜蛋白；（3) 除去所述步骤（2)中的非离子表面活性剂得到纯化猪伪狂犬病毒抗原；以及（4)使用所述 步骤（3)中制备的抗原制备疫苗组合物。
[0009] 作为一种可选择方式，上述"提供含有猪伪狂犬病毒的液体"是指通过将伪狂犬病 毒接种于易感的动物细胞进行增殖所获得的液体培养物。
[0010] 作为本发明的一种实施方式，所述步骤（1)中含有猪伪狂犬病毒的液体为使用细 胞培养收获的猪伪狂犬病毒培养液；所述细胞包括ST细胞系、PK-15细胞系、非洲绿猴肾 细胞Marc-145细胞系、牛肾细胞MDBK细胞系、牛睾丸传代细胞BT细胞系、Vero细胞系、 BHK-21细胞系、猪肾传代细胞系IBRS-2、兔肾传代细胞系RK，或者鸡胚成纤维细胞和猪肾 细胞的原代细胞。
[0011] 使用上述传代细胞和原代细胞用于制备猪伪狂犬病毒的方法可以采用本技术领 域的常规方法进行。
[0012] 作为本发明的一种实施方式，所述制备含有猪伪狂犬病毒的液体使用细胞悬浮培 养方法制备猪伪狂犬病毒。
[0013] 作为本发明的一种实施方式，所述制备含有猪伪狂犬病毒的液体使用微载体作为 细胞载体以制备猪伪狂犬病毒。
[0014] 任何可以具有免疫活性的猪伪狂犬病毒均可以用于本发明，优选地，所述的伪狂 犬病毒为伪狂犬变异株。
[0015] 术语"猪伪狂犬变异株"也称为高致病性猪伪狂犬毒株，是指：表现为任何年龄的 猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短（1?2天），发病率在10%?100%之间，发病 猪死亡率在10%?100%之间（仔猪死亡率可高达100%)，感染后可引起猪只高热（40? 42°C，持续3日以上），呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐， 侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流 产（高达35%)，早产，死胎，弱仔（弱仔14日龄前全部死亡）等繁殖障碍症状。
[0016] 作为本发明的一种实施方式，含有猪伪狂犬病毒的液体为使用传代细胞培养收 获的猪伪狂犬病毒变异株的培养液，所述猪伪狂犬病毒变异株为猪伪狂犬病毒HN1201株 以及猪伪狂犬HN1201株的gE基因缺失株、JS-2012株、猪伪狂犬HeNl、NVDC-PRV-BJ株、 NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株、猪伪狂犬病毒HN1202株、PRVTJstrain、猪伪狂犬病 毒变异株PRV-ZJ01。
[0017]猪伪狂犬病毒HN1201 株（Pseudorabiesvirus,strainHN1201)保藏号为CCTCC NO.V201311 ;保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉?武汉大学，保藏日 期为2013年5月20日。JS-2012株公开信息为：童武，张青占，郑浩等，免疫后发病仔猪中伪 狂犬病毒的分离和鉴定[J].中国动物传染病学报2013, 21(3) : 1-7)。猪伪狂犬HeNl株保藏 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCCN0. 6656,公 开于专利申请CN102994458A。NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株公开信息 为：XiulingYu,ZhiZhou,DongmeiHu,etal.PathogenicPseudorabiesVirus,China, 201 2EmergingInfectiousDiseases,www.cdc.gov/eidol. 20,No. 1,January2014。猪伪狂犬 病毒HN1202 株（Pseudorabiesvirus,strainHN1202)保藏号为CCTCCNO.V201335;保藏 于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉?武汉大学，保藏日期为2013年8月26 日。PRVTJ(PRVTJ)株，公开于ChinaChun-HuaWangJinYuanl，Hua_YangQinl，etal，A novelgE-deletedpseudorabiesvirus(PRV)providesrapidandcompleteprotection fromlethalchallengewiththePRVvariantemerginginBartha-K61_vaccinated swinepopulationinChinaVaccine32(2014)3379 - 3385。猪伪狂犬病毒变异株 PRV-ZJ01，其保藏号为CGMCCNo. 8170 公开于CN103627678A。
[0018] 猪伪狂犬变异株的基因缺失株包括但不限于中国专利申请CN103923884A公开的 缺失gE基因的猪伪狂犬HN1201株，中国专利申请CN103756977A公开了猪伪狂犬病gE和 gl基因缺失病毒株PRV-ZJ011G株（保藏号为CGMCCNo. 7957)，中国专利申请CN102994458A 公开了猪伪狂犬病gE缺失株，保藏号为CGMCCNO. 6657。
[0019] 使用上述传代细胞和原代细胞用于制备猪伪狂犬病毒变异株的方法可以采用本
技术领域的常规方法进行。<