用于递送能调节干扰rna内源性机制的核苷酸序列的制剂的制作方法
【专利说明】用于递送能调节干扰RNA内源性机制的核苷酸序列的制剂
[0001] 本发明涉及一种用于递送核苷酸序列的纳米乳剂型制剂，所述核苷酸序列能够调 节干扰RNA的内源性机制。
[0002] RNA干扰的机制是一种基因表达的转录后抑制机制，其基于特异性降解靶mRNA并 高度选择性、特异性抑制蛋白表达的双链小干扰RNA。该机制在细胞质中发生，并涉及一种 多蛋白复合物，称为RISC复合物（RNA-诱导的沉默复合物）。
[0003] 自从发现了这一自然机制后，能够调节干扰RNA内源性机制的核苷酸序列作为多 个生物领域中的研宄工具被应用于大量的学术和/或药学实验中。例如，能够调节干扰RNA 内源性机制的核苷酸序列被用于检测多种疾病的新治疗靶标。通过高选择性和特异性的抑 制给定蛋白的表达，就可能证实其在疾病发展进程中所起的作用。然而将外源性遗传物质 插入细胞中（转染）需要合适的物理、化学或生物学方法使得能够调节RNA干扰的内源性 机制的这些核苷酸序列-通常都是大分子（> IOKDa)且带负电荷-通过形成真正屏障的 带负电荷质膜。
[0004] 在所提到的物理方法中，可由电穿孔或通过超声在细胞膜上形成孔洞。在生物学 方法中，可借助专门递送核酸的系统，如病毒。在化学方法中，可采用：
[0005] -脂质体复合物（由核酸和阳离子脂质体形成的复合物），如lipofectamine? 2000，
[0006] -多聚复合物（由核酸和阳离子聚合物（例如聚乙烯亚胺PEI)形成的复合物），
[0007] -由核酸和树枝状分子（如含有聚酰胺-胺PANAM的树枝状分子）形成的复合物，
[0008] -脂质体多聚复合物（由核酸、脂质体和聚合物形成的复合物），例如SNALP(《稳 定核酸-脂质颗粒》），对应于阳离子脂质和由聚乙二醇（PEG)型聚合物稳定的辅助形成脂 质体混合物；
[0009] -核酸和高分子聚（DL-丙交酯-共-乙交酯）PLGA纳米颗粒之间形成的复合物。
[0010] 据发明人所知，仅 Park 等（Molecular Pharmaceutics 5, 4, 622-631，2008)描 述了采用脂质纳米颗粒用于递送siRNA。脂质纳米颗粒含有胆固醇，1，2-二油酰-sn-甘 油-3-磷酰乙醇胺（DOPE)和SiRNA衍生物，并用于转染以及GFP蛋白的敲减。然而，为了防 止SiRNA自纳米颗粒泄露，将上述物质与其进行共价结合。将SiRNA共价连接于间插入纳 米颗粒中的聚（氧乙烯）链，从而固定siRNA。此外，为了对转染进行示踪，还将荧光标记物 (显影剂）与siRNA共价结合。然而，对SiRNA的任何化学修饰均可能造成其变性。此外， Park等所采用的技术需对每个所用的SiRNA进行化学修饰，非常费时且昂贵。因此，需要提 供一种用于递送核苷酸序列的系统，所述核苷酸序列可调节RNA干扰内源性机制，其中，这 些序列不经过化学修饰。
[0011] 此外，专利申请WO 2010/018223中描述了用于递送双性或亲脂性治疗药物的纳 米乳剂型制剂，其含有一水相，和至少一含有两性脂质、溶解脂质、治疗药物、和辅助表面活 性剂的分散相，所述辅助表面活性剂含有至少一种由氧化烯重复单元组成的链。所述治疗 剂可以是siRNA。然而，由于siRNA为亲水性化合物，它们会包含在纳米乳剂的连续水相中 而不在分散相中。因此，该申请中描述的制剂就不适于递送可调节干扰RNA内源性机制的 核苷酸序列。此外，本发明人证明在W02010/018223中描述的所有制剂，尤其是实施例中描 述的那些，甚至是含有完整的阳离子表面活性剂的那些也不适用于本申请，因为复合率太 低，转染不够有效。如下所述，只有含有特定组分比例的制剂才能递送可调节干扰RNA内源 性机制的核苷酸序列。
[0012] 同样的，包含了水包油乳剂或脂质液滴的用于递送脱氧核糖核酸（DNA)的体系已 为人所知。在这些体系中，脂质液滴含有阳离子表面活性剂并由此使DNA和液滴之间通过 静电相互作用而结合。
[0013] 例如 Del Pozo-Rodriguez 等(International Journal of Pharmaceutics，385, 2010, 157-162)观察了在静脉内注射脂质纳米颗粒后小鼠肝脏和肾脏 中出现的荧光，所述脂质纳米颗粒含有表达荧光蛋白EFGP的裸质粒DNA(pDNA)、:p recir〇r ΑΤΟ 5、吐温（Tween)80和1，2-二油酰-3-三甲基丙基氯化铵（DOTAP)(阳离子表面活性 剂），以便用于HEK293细胞的体外转染和在施用于小鼠后的体内（转染）。
[0014] Tabatt 等(European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 57,2004，155)描述了固体脂质纳米颗粒的应用，其含有Compritol ATO 888或十六烷 酸鲸蜡醇酯、吐温80、Span85、选自烷基二甲基苯氯化铵（BA)、十四烷基三甲基溴化铵 (CTAB)、十六烷基氯吡啶（CPC)、二甲基二油酰基溴化铵（DDAB)、N，N-双_(b_硬脂酰乙 基）_N, N-二甲基氯化按（醋季按盐（Esterquat) 1，EQ1)和8_Ν-[1-(2, 3,-二油酰氧基） 丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵（DOTPA)的表面活性剂以供C0S-1细胞的体外转染。
[0015] 这两个文献中都使用了吐温80。然而其对细胞具有某些毒性。此外，吐温80含有 包含了 20个环氧乙烷单元的聚（环氧乙烷）链。如下所述，本发明人证实具有更长聚（环 氧乙烷）链（至少25个环氧乙烷单元）的表面活性剂更易成剂、更稳定，更有效地保护制 剂中所含核苷酸序列以抵抗外界介质。
[0016] 最后，所述能调节RNA干扰内源性机制的核苷酸序列，尤其是siRNA，通常不如DNA 稳定。此外，DNA和SiRNA的生物学活性非常不同，这意味着适于递送DNA的体系并不一定 也同样适用于递送siRNA。特别是，即使在任一情况中，一前提是递送体系能进行有效转染， 这对于递送siRNA的体系也是不充分的，该系统仅在能进行基因沉默下是有利的。
[0017] 因此，需要开发新的制剂，其能够体内和体外递送可调节RNA干扰内源性机制的 核苷酸序列。
[0018] [制剂]
[0019] 为此目的并根据本发明第一方面，提供了一种纳米乳剂形式的制剂，其包含一连 续水相和至少一分散相。
[0020] 本发明提供了一种包含可调节干扰RNA内源性机制的核苷酸序列的制剂，其可递 送所述的序列。
[0021] 还提供了所谓的"预混物"制剂，其不含可调节干扰RNA内源性机制的核苷酸序 列，其可以通过将可调节RNA干扰内源性机制的核苷酸序列和该"预混物"制剂混合，从而 制备含有可调节RNA干扰内源性机制的核苷酸序列的制剂。因此，该"预混物"制剂可方便 地与根据最终制剂所需的应用作改进的可调节RNA干扰内源性机制的核苷酸序列形成复 合物。
[0022] [预混物类型制剂]
[0023] 本发明的第一目的是在于提供一种纳米乳剂形式的制剂，其包含一连续水相和至 少一分散相，且含有：
[0024] -至少5mol %的两性脂质；
[0025] -15_70mol%的至少一种阳离子表面活性剂，其含有：
[0026] -至少一个亲脂性基团，选自：
[0027] -R或R_(C = 0)-基，其中R为具有11-23个碳原子的线形烃链，