一周后开始制备肝纤维化小鼠模型。选择模型组、秋水仙碱组、中药组合物高剂量组、中药 组合物中剂量组、中药组合物低剂量组、中药组合物极低剂量组昆明小鼠制备肝纤维化小 鼠模型。采用30%CCl4制成橄榄油剂，按Iy1/g比例小鼠腹腔注射，每周注射2次，共8 周。注意采用无菌注射器，让小鼠充分休息，防止感染。于第8周后，各组小鼠随机尾静脉 采血进行化验，确认肝纤维化小鼠模型制备成功。同时对照组采用同样的方法在小鼠的腹 腔注射等量的100%橄榄油。各组小鼠腹腔注射相应的药物后，小鼠全部存活，模型稳定，可 以进行后续的实验研宄。
[0076] 2. 3实验给药
[0077] 北豆根临床患者标准体重的剂量选择15g，天南星临床患者标准体重的剂量选择 9g，通天草临床患者标准体重的剂量选择15g，共计每副药材北豆根、天南星、通天草的中药 组合物39g。
[0078] 实验根据人与小鼠的体表面积比值是I:0.0026的换算关系，确定每20g小鼠 的剂量是39X0. 0026 = 0. 1014g，通过换算成kg，得到每kg标准体重小鼠的给药剂量是 5. 07g?kg-1 ?cf1，选择5. 07g?kg-1 ? (T1为中药组合物的中剂量，选择10. 14g?kgH? (T1为 中药组合物的高剂量，选择2. 54g?kg4 ?Cf1为中药组合物的低剂量，选择I. 27g?kgH?Cf1 为中药组合物的极低剂量，即设定高、中、低、极低剂量（10. 14、5. 07、2. 54、1. 27g 四个剂量开展肝纤维化小鼠模型的实验研宄。
[0079] 选择西药秋水仙碱治疗肝纤维化小鼠模型，秋水仙碱成人的每d剂量是3mg，确定 每20g小鼠的剂量是3X0. 0026 = 0. 0078mg，通过换算成kg，得到每kg标准体重小鼠的给 药剂量是〇. 39mg?kg4 ?cf1，即0. 00039g?kg4 ? (T1为每kg标准体重小鼠秋水仙碱的给药 量。
[0080] 对照组、模型组小鼠给予等量的生理盐水灌胃，秋水仙碱组给予秋水仙碱 0. 00039g?kg_i?Cf1灌胃，中药组合物高剂量组给予中药组合物10. 14g?kg?Cf1灌胃、中 药组合物中剂量组给予中药组合物5. 07g?kg4 ?Cf1灌胃、中药组合物低剂量组给予中药 组合物2. 54g?kg4 ?Cf1灌胃，中药组合物极低剂量组给予中药组合物I. 27g?kg+1 ?Cf1灌 胃，灌胃持续时间为30d。
[0081] 2. 4 检测血清ALT、AST、AKP含量
[0082] 实验结束后，眼科镊子摘除小鼠眼球，眼球采血，静置，3000rpmmirr1离心lOmin， 取上清液，分装，_80°C冰箱保存备用。血清生化指标ALT、AST、AKP分别按照试剂盒说明书 进行操作，其中ALT采用金氏法进行测定，AST采用赖氏法进行检测。实验采用医院全自动 生化分析仪器进行测定ALT、AST、AKP，得到实验数据，进行统计分析。
[0083] 2. 5检测肝组织Hyp含量
[0084] 实验结束后，取材各组小鼠肝右叶的相同部位0.lg，按照试剂盒方法消化，匀浆、 离心、制备样本。采用6010型可见紫外分光光度计测定Hyp蛋白的含量。
[0085] 2. 6检测肝纤维化密切相关指标HA、LN、PCIII、CIV含量
[0086] 实验结束后，眼球采血，静置，3000rpm?mirT1离心lOmin，取上清液，分装，-80°C冰 箱保存备用。HA、LN、PCIII、CIV按照试剂盒的说明书采用放射性免疫法进行检测，得到数 据进行统计分析。
[0087] 2. 7检测脾脏、肝脏、胸腺的脏器指数
[0088] 实验结束后，超净工作台上放置冰台进行操作，迅速断头处死各组昆明小鼠，取材 各组小鼠的脾脏、肝脏、胸腺器官，电子天平精确称取小鼠脾脏、肝脏、胸腺的脏器质量，计 算小鼠脾脏、肝脏、胸腺器官的脏器指数。
[0089] 脏器指数（mg? 〇 =脏器质量（mg) /体重（g)
[0090] 2. 8检测肝组织TGF- 0 1、RLX、TMP-I蛋白水平
[0091]肝组织TGF-M、RLX、TMP-I蛋白水平检测采用酶联免疫法进行检测，具体原理 是酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合，滴加底物溶液后，底 物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，这样就会出现颜色 反应，通过颜色的深浅来评价蛋白表达水平。
[0092] 实验结束后，各组小鼠断头处死，迅速取肝组织，生理盐水洗涤，剪碎，匀浆，然后 转入EP管，4°C冰箱静置30min，离心30min，取上清，进行分装、低温保存。按酶联免疫试剂 盒说明书进行操作，使用6100型RT-雷杜酶标仪450nm波长处测定培养板各孔吸光度（A)， 根据标准曲线求得肝脏组织TGF-M、RLX、TMP-I蛋白的含量。
[0093] 2. 9电镜观察肝组织形态学
[0094] 实验结束后将小鼠采用水合氯醛进行麻醉，固定小鼠四肢和头部，剪开皮肤、剪开 腹腔、剪开胸腔、寻找心脏，确定小鼠心脏左心室跳动最活跃的心尖处。剪开小鼠的右心耳， 使用输液器的输液针头扎入小鼠的左心室心尖处，缓慢匀速点滴50ml的生理盐水，冲刷小 鼠的循环系统，直到小鼠的肝脏变白后，停止输入生理盐水，改用2. 5%戊二醛缓慢匀速灌 注小鼠左心室心尖处，直到小鼠的四肢出现明显的僵硬。
[0095] 寻找昆明小鼠腹腔内的肝脏组织，选取肝脏组织的肝右叶同一部位，剪成1-2_3 的小块，放入2. 5%戊二醛中，经过2. 5%戊二醛预固定2h、继续用四氧化锇固定、脱水、包 埋、切片、染色、观察肝右叶同一部位组织结构。
[0096] 2. 10测定体重
[0097] 实验结束前最后测定昆明小鼠体重，以最后称量昆明小鼠体重为实验统计数据， 计算比较各组小鼠的体重差异。
[0098] 2. 11统计分析
[0099] 采用SPSS19. 0软件进行统计学处理，实验数据采用S±S.表示，多组间比较采用单 因素方差分析实验数据。
[0100] 3 结果
[0101] 3. 1中药组合物对肝纤维化小鼠模型ALT含量的影响
[0102] 实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠模型ALT的含量明显升 高（P< 0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量 组肝纤维化昆明小鼠模型ALT的含量明显降低（P< 0. 05)，差异有统计学意义；与模型组 比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型ALT的含量改变不明显（P> 0. 05)，差 异无统计学意义（见表1、图1)。
[0103] 表1中药组合物对肝纤维化小鼠模型ALT含量的影响(S±s)
[0104]
【主权项】
1. 一种治疗肝纤维化的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药组成：北豆 根10-20份、天南星5-15份、通天草10-20份。
2. 根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药组成：北豆 根15份、天南星9份、通天草15份。
3. 根据权利要求1或2所述的中药组合物，其特征在于，所述的原料药粉碎后加入制备 不同剂型时所需的辅料，按照药物制剂常规方法制成临床上适宜的制剂。
4. 根据权利要求3所述的中药组合物，其特征在于，所述的制剂包括散剂、水煎剂、胶 囊剂、丸剂、颗粒剂、片剂或口服液。
5. 权利要求1-4任一项所述的中药组合物在制备治疗肝纤维化药物中的用途。
【专利摘要】本发明公开了一种治疗肝纤维化的中药组合物及其制备方法和应用，属于中药领域。本发明中药组合物由以下重量份的原料药组成：北豆根10-20份、天南星5-15份、通天草10-20份。药理学实验结果表明，本发明中药组合物可以改善肝纤维化昆明小鼠的血清生化指标ALT、AST、AKP含量水平，改善肝组织Hyp含量水平，改善肝纤维化小鼠模型脾脏、肝脏和胸腺的脏器指数，改善肝纤维化小鼠模型HA、LN、PCIII、CⅣ含量水平，改善肝纤维化肝组织TGF-β1、RLX、TIMP-1蛋白表达水平，改善肝纤维化肝组织超微结构，并且对小鼠体重无明显的影响。由此可见，本发明中药组合物对肝纤维化的治疗效果明显，无副作用。
【IPC分类】A61K36-89, A61P1-16
【公开号】CN104800474
【申请号】CN201510242522
【发明人】张英博, 费洪新
【申请人】齐齐哈尔医学院
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月13日