弓形体属的减毒株用于预防或治疗隐孢子虫病的用图
【专利说明】弓形体属的减毒株用于预防或治疗隐孢子虫病的用途
[0001] 本发明涉及寄生虫减毒株用于预防或治疗与顶复门动物相关的病理学状况的用 途。
[0002] 顶复门动物是大多数地细胞内的专性寄生虫，其具有可以涉及数个宿主的生活 史。这些寄生虫的门细分为几个科。
[0003] 鼠弓形体（Toxoplasma gondii (T. gondii))属于肉抱子虫科（Sarcocystidae) 〇 该原生动物以随着宿主和感染阶段而变化的三种感染形式存在：
[0004] 鲁速殖子：在中间宿主（即所有恒温动物）和终宿主（即猫科动物，特别是猫）的 细胞中无性繁殖的增殖和感染形式，
[0005] 鲁慢殖子：包含在包囊中的该寄生虫的具有缓慢分裂和低代谢水平的形式，
[0006] ?子孢子：包含在卵囊中的形式，其产生自该寄生虫在终宿主（即猫和其他猫科 动物）的肠中的有性繁殖。
[0007] 猫（该寄生虫的终宿主）通过摄入包含包囊（或速殖子，如果动物处于弓形体病 的急性期）的被寄生的猎物或通过摄入卵囊而受到感染。在经由配子囊于猫科动物的肠中 进行有性繁殖后，卵囊被散布到环境中。这些卵囊在外部环境中形成孢子，并且其致病性持 续至少一年。在卵囊摄入后，所释放出的子孢子感染终宿主或中间宿主的肠细胞并转变为 在生物体中散布的速殖子。在免疫系统的压力下，速殖子被包于包囊内，具有对于中枢神经 系统、视网膜或肌肉的优先向性。摄入含包囊的组织是污染终宿主和中间宿主的第二个原 因。在摄入包囊后，慢殖子被释放并感染肠上皮细胞，并且转变为在宿主中散布的速殖子。
[0008] 鼠弓形体株系按照其体内毒力程度来进行分类型株系（即株系RH)是高毒力 的，而II型（即株系ME49、76K或Pru)和III型（即株系CEP或M7741)株系是毒力较小 的并且通常建立慢性感染。此外，鉴定出了许多不能归于这三种主要类型的非典型株系， 尤其是在非洲和南美洲（Howe DK 等人，1995, J. Infect. Dis.，171，1561-1566 ;Rajendran C 等人，2011，Infect. Genet. Evol.，12, 359-368 ;Mercier A 等人，2010, PLoS Negl. Trop. Dis. , 4, e876) 〇
[0009] 最近，通过使编码蛋白TgMICl和TgMIC3的两个基因无效而制作出了鼠弓形体 (对弓形体病负有责任的寄生虫）的减毒活株系（EP 1 703 914 Bl和US 7, 964, 185 B2/ C6r6de 等人，2005, J. Exp. Med. ,201:453-63)。称为 Toxo micl-3 KO 的该株系产生针 对鼠弓形体的强烈且特异的免疫应答，并且使得能够在小鼠中（]S11ia以等人，2005, J. Infect. Dis.，194:1176-1183)和还有在母羊中（Mevelec 等人，2010, Vet. Res. ,41:49)预 防以后感染的效应。还已经证明，体内毒力仅非常少地受到TgMICl或TgMIC3的孤立失活 的影响；相反地，通过这两种蛋白质的同时失活强烈地降低了体内毒力，这表明了这两种蛋 白质的协同作用（C6i^de 等人，2005J. Exp. Med.，201:453-63)。
[0010] 犬新孢子虫（Neospora caninum)是对新孢子虫病负有责任的细胞内寄生虫。它 也属于肉孢子虫科。犬新孢子虫的生活史非常近似于鼠弓形体的生活史，具有两个不同的 阶段：在终宿主（即犬科动物，特别是狗）中的有性阶段，其导致包含子孢子的卵囊的产生， 所述卵囊被排到粪便中；和在中间宿主（即绵羊、山羊、牛、马科动物等）中的无性阶段，其 导致速殖子的产生和随后包含慢殖子的包囊的产生。
[0011] 更近来，获得了犬新孢子虫的减毒活株系，株系Neo ncmicl-3KO,其已通过同源 重组而对于基因ncmicl和ncmic3而言被无效。在该株系中，用允许对于乙胺喃啶的抗性 的盒DHFR替代基因ncmic3,和用赋予寄生虫以对于氯霉素的抗性并使寄生虫发荧光的盒 CAT-GFP替代基因ncmicl。该寄生虫不再表达蛋白NcMICl和NcMIC3。已显示，该突变株具 有感染和免疫原特性，从而赋予哺乳动物以针对新孢子虫病的有害效应的疫苗保护。
[0012] 鼠弓形体和犬新孢子虫共同具有以多个步骤侵入宿主细胞的特殊过程，从而导致 形成寄生泡，在所述寄生泡中寄生虫进行繁殖和发育。
[0013] 隐孢子虫科（Cryptosporidiidae)是另一个属于顶复门的科，并且对隐孢子虫病 负有责任，所述隐孢子虫病是极其常见的疾病，其通过存在于它们食物中的寄生虫的摄入 而影响尤其是人和许多动物物种，包括农用动物（绵羊、山羊、牛等）。在这之后，寄生虫在 肠中进行繁殖，首先按照无性方式，然后其次按照有性方式。被污染的个体排出并再次散布 寄生虫，其因此污染了它们的环境（即牧场、水等）。
[0014] 已经鉴定出了隐孢子虫科的数个物种，其中小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum)是最常见和最具毒力的一种。
[0015] 在人中，隐孢子虫病是一种通常良性的疾病。然而，该疾病（其发病率每年增长， 尤其在美国）的后果在幼儿和受到免疫抑制的人（特别是被HIV病毒感染的患者）中可能 是极其严重的。因此，在这些群体内，隐孢子虫病是造成严重腹泻的原因，所述严重腹泻可 以产生大量脱水，甚至如果没有适当的治疗，可以产生个体死亡。
[0016] 在有免疫能力的成年动物中，隐孢子虫病也是良性的。相反地，在年龄为几天至几 周并且其免疫系统未成熟的非常年幼的动物中，隐孢子虫病通常具有严重的后果。因此，隐 孢子虫属物种（Cryptosporidum spp)，尤其是小隐孢子虫，被证实是新生动物腹泻的最常 见的病因学因子，所述新生动物腹泻产生重大的生长迟缓，并且如果没有适当的治疗，对于 动物来说可以是致命的。
[0017] 新生动物腹泻对牛、绵羊和山羊的饲养者来说构成了持久不变的威胁，并且意味 着巨大的经济损失，这是由于因生长迟缓、新生动物死亡、兽医介入以及治愈性治疗和补 液的花费而引起的收入损失。新生动物腹泻的病因学经常是事实上对这些症状负有责任 的多重的多种感染因子，尤其是轮状病毒、冠状病毒、BVDV病毒（牛病毒性腹泻病毒）、 大肠杆菌（Escherichia coli)和当然还有小隐孢子虫。这些各种不同的感染因子在反 刍动物的新生动物腹泻中的作用是难以估计的，因为很少进行诊断并且经常存在多重感 染。然而，小隐孢子虫目前被认为是新生动物腹泻的主要因素（de Graaf等人，1999, Int. J. Parasitol. ,29:1269-1287)。因此，在患有新生动物腹泻的小牛上进行的研宄已表明，它 们之中的40%被小隐孢子虫感染并且其中3/4不具有任何其他感染因子（位于布鲁塞尔 的"兽医学和农业化学研宄中心（Veterinary and Agrochemical Research Centre)"的数 据）。
[0018] 为了减少症状的强度和持续时间，已在各种不同的模型中评价了许多分子，但是 没有一个给出令人满意的结果。因此，在家养反刍动物中，仅乳酸卤夫酮（HaloCur?) 和巴龙霉素给出了令人感兴趣的结果，但并不允许寄生虫的完全控制（Chartier，2002, Le Point v6t6rinaire Pathologie ovine et caprine, 112-117)。在人中，特别是对于治疗 艾滋病患者，通常的治疗基于巴龙霉素（Humatin)或硝唑沙奈的使用。这两种分子具有相 似的效力，但是硝唑沙奈被判断具有较低毒性。此外，最近制作出了对于鼠弓形体和犬新孢 子虫的钙依赖性蛋白激酶特异的抑制剂（WO 2011/094628 Al)。它们尤其是属于吡唑并嘧 啶类和咪唑并[1，5-a]吡嗪类的化合物。这些抑制剂影响所述寄生虫的侵入和增殖的能 力，而不干扰宿主细胞的生物学活性。
[0019] 总之，无论在人中还是在动物中，目前都不存在任何使得能够有效地对抗隐孢子 虫病的特异性治疗，并且仅有基于严格卫生守则的预防使得能够减少摄入被小隐孢子虫污 染的水或食物。
[0020] 因此，对于用于在哺乳动物（尤其是具有未成熟或缺陷的免疫系统的哺乳动物） 中预防和治疗隐孢子虫病的试剂存在着真正需要。事实上，由于感染可以在最初几天期间 发生，新生动物具有处于发育过程中的免疫系统，这使得在年幼动物中的传统的疫苗接种 方案是不可能的。因此，在高度地方性流行的地区中用杀死的寄生虫在新生小牛上进行的 预防试验未显示任何显著的保护作用（Harp等人，1996, Am. J. Vet. Res. ,57:1586-1588 ; Harp 等人，1998, J. Dairy. Sci. 81:289-294)。
[0021] 然而，已证明，针对小隐孢子虫的免疫应答导致发展出Thl类型的保护性应答，其 具有细胞因子IL-12和IFN-Y的大量产生。还证明，这些细胞因子能够减低感染的影响 (Lacroix 等人，2001，Infect. Immun. ,69:1635-42)。
[0022] 本发明的目标之一是提供免疫刺激剂，其能够在新生动物中诱导具有IL-12和 IFNy的产生的非特异性免疫应答。
[0023] 本发明的另一个目标是提供免疫刺激剂，其能够限制小隐孢子虫对于哺乳动物 (人或动物）的感染的效应。
[0024] 本发明的另外一个目标是提供针对隐孢子虫病的预防性治疗，尤其是疫苗。
[0025] 本发明的目标在于从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物 种（Toxoplasma spp)或新孢子虫属物种（Neospora spp)的肉孢子虫科株系，其用于在哺 乳动物中预防或治疗与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况之中使用。
[0026] 本发明的目标在于从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自减毒弓形体 属物种或减毒新孢子虫属物种的肉孢子虫科减毒株系，其用于在哺乳动物中预防或治疗与 隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况之中使用。
[0027] 本发明的目标在于从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物 种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系，其用于在哺乳动物中预防或治疗与隐孢子虫科的 顶复门动物相关的病理学状况之中使用，所述株系具有相对于诱导与弓形体属物种或新孢 子虫属物种相关的病理学状况的野生株而言减弱的毒力。
[0028] 作为例子但这并不限制本发明的范围，顶复门动物的此类野生株可以通过RH类 型的鼠弓形体的强毒株（对于弓形体病）或者NCl类型的犬新孢子虫的强毒株（对于新孢 子虫病）来进行举例说明。
[0029] 本发明的目标在于从其天然环境中分离并具有免疫刺激效应的选自弓形体属物 种或新孢子虫属物种的肉孢子虫科株系，其用于在哺乳动物中预防或治疗与隐孢子虫科的 顶复门动物相关的病理学状况之中使用，所述株系具有相对于强毒株（即具有与从其获得 毒力减弱的株系的那个株系的毒力基本上相同的毒力的株系）而言减弱的毒力。
[0030] "免疫刺激"意指弓形体属物种或新孢子虫属物种的株系诱导宿主免疫系统的早 期激活的能力。该激活牵涉免疫系统的组分例如干扰素、细胞因子、吞噬细胞、NK细胞（天 然杀伤细胞）、树突细胞和补体系统，其将会非特异地作用于所靶向的病原体。该免疫刺激 并不基于适应性免疫的建立。
[0031] "预防"意指目的在于阻止疾病出现或蔓延的预防方法。它尤其涉及保护倾向于染 上和发展出与隐孢子虫科的顶复门动物相关的病理学状况的个体。这样的个体尤其为具有 未成熟的免疫系统的新生动物或这具有免疫系统功能障碍的个体。它还涉及保护暴露于来 自其环境的污染风险的哺乳动物。
[0032] "治疗"不仅意指病理学状况的进展的抑制，而且还意指与该病理学状况相关的症 状的减轻。治疗的目的在于减小症状的幅度直至其完全消失，从而允许个体恢复正常的生 理状态。
[0033] "哺乳动物"意指人类、某些农用或饲养动物和某些伴侣动物。
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