一种脂质体流感病毒抗原疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及流感病毒抗原疫苗领域，特别涉及一种脂质体流感病毒抗原疫苗及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 现有技术中，用于治疗流行性感冒的表位疫苗主要由化学合成，由于抗原表位仅 代表了蛋白抗原的一部分，很难像蛋白抗原疫苗一样诱导出多种免疫反应；且表位疫苗通 常是线性的，不具备抗原蛋白上抗原表位所具有的立体构象。因而直接用表位肽免疫很难 引起较强的免疫应答。虽然通过表位肽与载体分子连接后可在短期内诱导较好的免疫应 答，但是很难保证其免疫应答的特异性，且为达到较好的免疫效果，一方面所需免疫原剂量 大，另一方面需要联合使用佐剂，使其进一步临床应用受到很大限制。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中表位疫苗难以诱导出多种免疫反 应，且难以引起较强的免疫应答，临床应用受到限制等缺陷，提供一种脂质体流感病毒抗原 疫苗及其制备方法。
[0004] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种脂质体流感病毒抗原疫苗 的制备方法，采用薄膜蒸发法，
[0005] 包括以下步骤：
[0006] (1)流感病毒抗原疫苗原液的制备：
[0007] 取任意一种或多种流感病毒毒株，分别接种于病毒培养基上，在33°C~35°C的温 度下培养48~72小时后，提取流感病毒体，经甲醛灭活，超滤浓缩、纳米对撞机裂解病毒 及柱层析纯化后制成流感病毒抗原疫苗原液；
[0008] (2)空脂质体的制备过程为：
[0009] 将磷脂、胆固醇以及抗氧化剂混合溶于有机溶剂中，真空旋转蒸发后，得到膜状的 空脂质体；
[0010] ⑶水化：
[0011] 向步骤（2)中获得的空脂质体中加入碱性缓冲液，旋转蒸发，待水化完全后，加入 步骤（1)制得的流感病毒抗原疫苗液，获得粗制脂质体；
[0012] (4)高压匀浆：
[0013] 将步骤（3)中获得的粗制脂质体用高压匀衆，除菌过滤即可。
[0014] 在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述步骤（3)水化过程 为：
[0015] 向空脂质体中加入pH7. 2的磷酸盐缓冲溶液，加入若干小玻璃珠或沸石，40°C旋 转蒸发，待膜状脂质体从茄型瓶瓶壁上完全脱落后，静置30min，使瓶中液体呈乳白色悬 浊液；取所述流感病毒抗原疫苗液加入所述空脂质体中。
[0016] 在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述水化过程中，加入 流感病毒抗原疫苗原液之前还包括以下步骤：向流感病毒抗原疫苗原液中加入细胞保护 剂。
[0017] 在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述细胞保护剂为海藻 糖，并使海藻糖在流感病毒抗原疫苗原液中的浓度为1%。
[0018] 在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述流感病毒毒株包括 甲1型、甲3型及乙型流感病毒毒株；所述病毒培养基为5-10日龄健康鸡胚。
[0019] 在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，
[0020] 所述磷脂包括大豆卵磷脂、卵磷脂、豆磷脂、脑磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯中的 一种或多种；
[0021] 所述有机溶剂为三氯甲烷、氯仿、乙醚、丙酮溶液中的一种或多种；
[0022] 所述抗氧化剂为维生素 E、维生素 C、维生素 A、类胡萝卜素中的一种或多种。
[0023] 在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述空脂质体的制备过 程为：
[0024] 将大豆卵磷脂、维生素 E、胆固醇分别按摩尔比（4-6) :1 : (2-4)混合溶于100mL三 氯甲烷中，置于旋转蒸发仪的茄型瓶中，在60°C-KKTC条件下水浴，真空旋转蒸发，成 膜，获得膜状空脂质体。
[0025] 在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述空脂质体的制备过 程为：
[0026] 取300mg注射用大豆卵磷脂、150mg胆固醇、50mg维生素 E混合溶于100mL三氯甲 烷中，将该液体置于旋转蒸发仪的茄型瓶中，60°C水浴作为蒸发温度，真空旋转蒸发，获 得膜状空脂质体。
[0027] 在本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法中，所述高压匀浆过程为： 将粗制脂质体用高压匀浆机在压力为15Kpa-30Kpa压力范围内，匀质5个循环，将脂质体颗 粒粒径勾质至200-400nm，除菌过滤。
[0028] 本发明进一步保护根据上述提供的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法所获得 脂质体疫苗。
[0029] 实施本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗及其制备方法，可以达到以下有益效 果：相对于线性的表位疫苗，具有立体抗原表位的脂质体疫苗不仅可以同时携带多个或多 种抗原，诱发多种细胞免疫反应并引起较强的免疫应答，而且脂质体疫苗性能较稳定，保存 期较长，同时，可减少免疫原剂量的使用量。
【附图说明】
[0030] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0031] 图1为采用发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗进行免疫的血清对H3N2病毒株 的标准抗原的ELISA检测；
[0032] 图2为采用发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗进行免疫的血清对HlNl病毒株 的标准抗原的ELISA检测；
[0033] 图3为采用发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗进行免疫的血清对B型病毒株的 标准抗原的ELISA检测。
【具体实施方式】
[0034] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。
[0035] 下述实施例中所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料， 若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0036] 本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗采用薄膜蒸发法进行制备，包括以下步 骤：
[0037] (1)流感病毒抗原疫苗原液的制备；
[0038] 取任意一种或多种流感病毒毒株，分别接种于病毒培养基上，在33°C~35°C的温 度下培养48~72小时后，提取流感病毒体，经甲醛灭活，超滤浓缩、纳米对撞机裂解病毒 及柱层析纯化后制成流感病毒抗原疫苗原液；
[0039] 其中，流感病毒毒株包括甲1型（HlNl)、甲3型（H3N2)及乙型三种目前最普遍的 流感病毒毒株，使得流感病毒抗原疫苗原液更具实用性；
[0040] ⑵空脂质体的制备；
[0041] 将磷脂、胆固醇以及抗氧化剂混合溶于有机溶剂中，真空旋转蒸发后，得到膜状的 空脂质体；
[0042] 其中，磷脂包括大豆卵磷脂、卵磷脂、豆磷脂、脑磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯中 的一种或多种；
[0043] 有机溶剂为三氯甲烷、氯仿、乙醚、丙酮溶液中的一种或多种；
[0044] 抗氧化剂为维生素 E、维生素 C、维生素 A、类胡萝卜素中的一种或多种；
[0045] 磷脂、抗氧化剂、有机溶剂按摩尔比为（4-6) :1 : (2-4)混合溶于100mL有机溶剂 中；
[0046] ⑶水化
[0047] 向步骤⑵中获得的空脂质体中加入碱性缓冲液，旋转蒸发，待水化完全后，加入 步骤（1)制得的流感病毒抗原疫苗液，获得粗制脂质体；
[0048] 其中，碱性缓冲液pH值为7. 2 ;
[0049] (4)高压匀浆：
[0050] 将步骤（3)中获得的粗制脂质体用高压匀浆