于0. 2的标准,氧化指数越小,说明脂质体疫苗越稳定,保存期越久。
[0093] 另外,免疫原性反应了疫苗进入机体后引起抗体产生免疫应答的强度和持续时 间,影响免疫原性强弱的因素包括机体的因素和疫苗的因素,免疫原性实际检测疫苗的有 效性的重要指标;因此本发明通过免疫原性的实验进一步验证实施本发明所获得的脂质体 疫苗的免疫效果,下面以实施例制备的脂质体流感病毒抗原疫苗为实验依据进行详述:
[0094] 具体地,本次研宄方法是将疫苗免疫小鼠后,检测体内产生的抗流感病毒的抗体 水平。将实施例1中制备得出的脂质体流感病毒抗原疫苗分别免疫接种于10只18~22 克昆明小鼠,每只小鼠皮下接种〇. 2ml ;另取对照组10只昆明小鼠,皮下接种生理盐水, 置相同条件下饲养。免疫21天后,分组采血,分离血清。以血凝抑制试验方法测定抗体 效价。
[0095] 实验结果:本发明实施例1中制备的脂质体流感病毒抗原疫苗对于H3N2型病毒株 产生的抗原免疫血清抗体滴度尤其高,滴度超过1200 ;对于HlNl型病毒株滴度为1000 ;乙 型(即B型)相似株滴度为900,H3N1、H1N1与B三种纯抗原在小鼠机体内引起的免疫应答 反应的强度依次为H3N2>H1N1>B。
[0096] 为了进一步检测脂质体流感病毒抗原疫苗刺激小鼠机体产生IgG抗体水平,采用 ELISA法对上述实验中免疫一定时间的小鼠血清进行测定,具体ELISA实验结果,如附图 1-3所示:
[0097] 图1-3中,横坐标为抗原测定时间,单位为小时;纵坐标为ELISA检测血清中的 抗体量,单位为mIU/mL,Flu-P (大)指利用平均粒径大于450nm的脂质体流感病毒抗原 疫苗进行测试的实验组,Flu-P(小)指利用平均粒径小于450nm的脂质体流感病毒抗原 疫苗进行测试的实验组,Flu-P(大)和Flu-P(小)均来源于实施例1中制备的流感病毒 抗原疫苗;Blank-LP指利用没有加入流感病毒抗原疫苗原液的脂质体进行测试的实验组; 空白对照为利用PBS缓冲液进行测试的对照组;阳性对照为利用普通流感病毒抗原疫苗 进行测试对照组。其中,血清中的抗体量和脂质体粒径均为实验中所获得平均值。由附图 1-3可知,H3N1、HlNl与B型三种纯抗原在小鼠机体内引起的免疫应答反应的强度依次为 H3N2>H1N1>B ;在42小时内,本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗刺激小鼠机体产生IgG 抗体量随着时间的推移逐渐增加,且均远远大于普通疫苗所刺激产生的抗体量;脂质体粒 径越小,免疫强度越高;故通过本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗制备方法所获得脂 质体疫苗具有较高的免疫应答强度。
[0098] 综上所述,通过上述实验证明,本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗制备方法 所制得的脂质体流感病毒抗原疫苗可同时携带多个或多种抗原,能够刺激细胞免疫反应, 而结合于脂质体表面的抗原能够相应刺激产生非T细胞依赖的IgM抗体等,总之,本发明提 供的脂质体流感病毒抗原疫苗不仅性能稳定,保存期久,而且可诱发多种免疫反应,免疫应 答强度较高,促进免疫细胞的积累,从而提高治疗指数,减少治疗剂量和降低毒性。
[0099] 以上结合附图对本发明的实施例进行了描述,但是本发明并不局限于上述的具体 实施方式,上述的【具体实施方式】仅仅是示意性的,而不是限制性的,本领域的普通技术人员 在本发明的启示下,在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下,还可做出很多 形式,这些均属于本发明的保护之内。
【主权项】
1. 一种脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法,其特征在于,采用薄膜蒸发法,包括以下 步骤: (1) 流感病毒抗原疫苗原液的制备: 取任意一种或多种流感病毒毒株,分别接种于病毒培养基上,在33°C~35°C的温度下 培养48~72小时后,提取流感病毒体,经甲醛灭活,超滤浓缩、纳米对撞机裂解病毒及柱 层析纯化后制成流感病毒抗原疫苗原液; (2) 空脂质体的制备过程为: 将磷脂、胆固醇以及抗氧化剂混合溶于有机溶剂中,真空旋转蒸发后,得到膜状的空脂 质体; (3) 水化: 向步骤⑵中获得的空脂质体中加入碱性缓冲液,旋转蒸发,待水化完全后,加入步骤 (1)制得的流感病毒抗原疫苗液,获得粗制脂质体; (4) 高压匀浆: 将步骤(3)中获得的粗制脂质体用高压匀浆,除菌过滤即可。2. 根据权利要求1所述的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法,其特征在于,所述步 骤(3)水化过程为: 向空脂质体中加入PH7. 2的磷酸盐缓冲溶液,加入若干小玻璃珠或沸石,40°C旋转蒸 发,待膜状脂质体从茄型瓶瓶壁上完全脱落后,静置30mi n,使瓶中液体呈乳白色悬浊液; 取所述流感病毒抗原疫苗液加入所述空脂质体中。3. 根据权利要求1所述的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法,其特征在于,所述水 化过程中,加入流感病毒抗原疫苗原液之前还包括以下步骤:向流感病毒抗原疫苗原液中 加入细胞保护剂。4. 根据权利要求3所述的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法,其特征在于,所述细 胞保护剂为海藻糖,并使海藻糖在流感病毒抗原疫苗原液中的浓度为1 %。5. 根据权利要求1-4任一项所述的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法,其特征在 于,所述流感病毒毒株包括甲1型、甲3型及乙型流感病毒毒株;所述病毒培养基为5-10日 龄健康鸡胚。6. 根据权利要求5所述的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法,其特征在于, 所述磷脂包括大豆卵磷脂、卵磷脂、豆磷脂、脑磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯中的一种 或多种; 所述有机溶剂为三氯甲烷、氯仿、乙醚、丙酮溶液中的一种或多种; 所述抗氧化剂为维生素E、维生素C、维生素A、类胡萝卜素中的一种或多种。7. 根据权利要求6所述的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法,其特征在于,所述空 脂质体的制备过程为: 将大豆卵磷脂、维生素E、胆固醇分别按摩尔比(4-6) :1 :(2-4)混合溶于100mL三氯甲 烷中,置于旋转蒸发仪的茄型瓶中,在60°C-KKTC条件下水浴,真空旋转蒸发,成膜,获 得膜状空脂质体。8. 根据权利要求7所述的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法,其特征在于,所述空 脂质体的制备过程为: 取300mg注射用大豆卵磷脂、150mg胆固醇、50mg维生素E混合溶于100mL三氯甲烷 中,将该液体置于旋转蒸发仪的茄型瓶中,60°C水浴作为蒸发温度,真空旋转蒸发,获得 膜状空脂质体。9. 根据权利要求1所述的脂质体流感病毒抗原疫苗的制备方法,其特征在于,所述高 压匀浆过程为:将粗制脂质体用高压匀浆机在压力为15Kpa-30Kpa压力范围内,匀质5个循 环,将脂质体颗粒粒径勾质至200-400nm,除菌过滤。10. -种脂质体流感病毒抗原疫苗,其特征在于,包括如权利要求5-9任一项所述的脂 质体流感病毒抗原疫苗制备方法所制得的脂质体流感病毒抗原疫苗。
【专利摘要】本发明涉及一种脂质体流感病毒抗原疫苗及其制备方法,采用薄膜蒸发法制备脂质体流感病毒抗原疫苗,包括流感病毒抗原疫苗原液的制备,空脂质体的制备及脂质体的合成等步骤,通过本发明提供的脂质体流感病毒抗原疫苗制备方法所制得脂质体流感病毒抗原疫苗,相对于线性的表位疫苗,不仅可以同时携带多个或多种抗原,诱发多种细胞免疫反应并引起较强的免疫应答,而且脂质体疫苗性能较稳定,保存期较长,同时,可减少免疫原剂量的使用量。
【IPC分类】A61K39/295, A61K39/145, A61K9/127, A61P31/16
【公开号】CN104983682
【申请号】CN201510395493
【发明人】曾宪卓, 鲁菲
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月8日