苯甲酸钠，做5次平行试验。将培养皿密封后置于恒温培养箱中37°C培养18h，采 用十字交叉法测量抑菌圈直径。以抑菌圈直径A和抑菌率R来评判供试药物的抑菌活性。
直径，接种菌种和结果见表1。
[0027] 在无菌条件下，将灭菌试管根据供试菌种的类型分为6组，每组12支。具体配置 如下：每组的第I支加入2倍浓度的LB液体培养基2mL，第II-X支试管加入LB液体培 养基2mL，向第I支试管中加入TFF提取液2mL，按照2倍稀释法，使各管药液浓度依次为： 50. 00、25. 00、12. 50、6. 25、3. 12、1. 56、0. 78、0. 39、0. 20、0. 00mg/mL，然后向这 10 支试管中 分别加入各菌种的菌悬液〇.lmL，第XI支管作为阳性对照，仅加入中LB液体培养基2mL，第 M支管作为阴性对照，加入2倍浓度的LB液体培养基ImL和TFF提取液lmL。将上述设置 试管置于37°C恒温培养箱内培养24h，从12支试管中分别取0.ImL涂布于固体LB培养基 平板上，37°C恒温培养箱内培养，以24h不长菌的总黄酮溶液浓度为最小抑菌浓度MIC，以 48h不长菌的提取液浓度为最小杀菌浓度MBC，接种菌种和试验结果见表2。
注：+表示有抑菌现象，-表示无抑菌现象。
[0029] 如表1所示，TFF对6种供试菌种均表现出良好的抑菌活性，而且6中供试 菌种对TFF的耐受性个体差异明显。试验表明，高剂量浓度作用下抑菌圈直径可达 12. 94±0. 63mm，和对照苯甲酸钠作用抑菌圈直径13. 02±0. 12mm相近，抑菌率高达 98. 67%，说明其对枯草芽孢杆菌菌丝生长抑制作用很强；TFF对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄 色葡萄球抑制作用次之；对青霉和黑曲霉抑制作用最弱，低剂量浓度作用下，抑菌圈直径仅 为8. 83±0. 34,抑菌率只有20. 68%。总之，各测试菌的抑菌圈直径大小随质量浓度的增大 而增大，抑菌率与TFF质量浓度呈正相关，TFF对细菌的抑制活性要强于其对真菌的作用。
[0030] 如表2所示，2倍黄酮浓度稀释法进一步通过MIC和MBC定量的测定其抑菌活性。 TFF对枯草芽孢杆菌的MIC为I. 56mg/mL，对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的MIC为6. 25mg/mL，对大肠杆菌、青霉和黑曲霉的MIC为12. 50mg/mL。表明TFF对金黄色葡萄球菌和沙门氏 菌均有很强的抑制活性，特别对枯草芽孢杆菌的抑作用最强，大肠杆菌、青霉和黑曲霉对其 抑制作用耐受性较强。
[0031] 对比例1 一种大吴风总黄酮双水相萃取工艺，包括如下步骤： 1) 大吴风粗提液的提取 准确称取〇. 5Kg大吴风粉末，加入提取剂体积分数为60%乙醇溶液15L，与大吴风粉末 混合，置于60°C恒温水浴锅中浸提I. 5h，离心，取上清液，得到粗提物； 2) 双水相萃取 将步骤1)得到的粗提液，加入C2H5OH- (NH4) 2S04形成的双水相体系，使粗提液在双水相 体系中的质量分数为19%，所述C2H5OH的质量分数为20%，所述（NH4) 2S04的质量分数为16%， 加入质量分数为2. 68%的NaCl，加入质量分数为0. 5%的羟丙基-P-环糊精，调节pH值为 7. 64,混勾，分相，分相温度为25°C，分相时间为2h。
[0032] 3)减压蒸馏、干燥 取出富含大吴风总黄酮的乙醇上相，进行减压蒸馏、浓缩溶液，然后将浓缩液在60°C进 行真空干燥，得到大吴风总黄酮0. 〇2Kg，UV检测含量95. 8%。
[0033] 对比例2 一种大吴风总黄酮微波辅助双水相萃取工艺，包括如下步骤： 1) 大吴风粗提液的提取 准确称取〇. 5Kg大吴风粉末，加入提取剂体积分数为60%乙醇溶液15L，与大吴风粉 末混合，浸提。首先在25°C下，对混合液微波处理25min，然后置于60°C恒温水浴锅中浸提 I. 5h，离心，取上清液，得到粗提物； 2) 双水相萃取 将步骤1)得到的粗提液，加入C2H5OH- (NH4) 2S04形成的双水相体系，使粗提液在双水相 体系中的质量分数为19%，所述C2H5OH的质量分数为20%，所述（NH4) 2S04的质量分数为16%， 加入质量分数为2. 68%的NaCl，调节pH值为7. 64,混匀，分相，分相温度为25°C，分相时间 为2h。
[0034] 3)减压蒸馏、干燥 取出富含大吴风总黄酮的乙醇上相，进行减压蒸馏、浓缩溶液，然后将浓缩液在60°C进 行真空干燥，得到大吴风总黄酮0. 〇61Kg，UV检测含量58. 0%。
[0035] 对比例3 一种大吴风总黄酮微波辅助双水相萃取工艺，包括如下步骤： 1) 大吴风粗提液的提取 准确称取〇. 5Kg大吴风粉末，加入提取剂体积分数为60%乙醇溶液15L，与大吴风粉 末混合，浸提。首先在25°C下，对混合液微波处理25min，然后置于60°C恒温水浴锅中浸提 I. 5h，离心，取上清液，得到粗提物； 2) 双水相萃取 将步骤1)得到的粗提液，加入C2H5OH- (NH4) 2S04形成的双水相体系，使粗提液在双水相 体系中的质量分数为19%，所述C2H5OH的质量分数为20%，所述（NH4) 2S04的质量分数为16%， 加入质量分数为2. 68%的NaCl，加入质量分数为0. 5%的-环糊精，调节pH值为7. 64,混 勾，分相，分相温度为25°C，分相时间为2h。
[0036] 3)减压蒸馏、干燥 取出富含大吴风总黄酮的乙醇上相，进行减压蒸馏、浓缩溶液，然后将浓缩液在60°C进 行真空干燥，得到大吴风总黄酮0. 〇62Kg，UV检测含量57. 5%。
[0037] 效果例1 粗提物的检测，对实施例1和对比例1-3过程中的参数进行检测，检测项目和结果见表 3,项目的检测方法如下： 粗提物的黄酮含量检测方法：取粗提物15ml，用60%的乙醇定容100ML，用亚硝酸 钠-硝酸铝分光光度法测定黄酮含量。
[0038] 步骤3)得到的大吴风总黄酮的检测方法：称取大吴风总黄酮g，用15ml60%的乙 醇定容至100mL，用亚硝酸钠-硝酸铝分光光度法测定黄酮含量。
[0039] 本发明中用的微波频率为915MHz，但是不局限于该频率，可以根据实际需要调整 频率和时间达到相同的效果，为本领域技术人员所公知常识，此处不再赘述。
[0040] 以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对 于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而 易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
【主权项】
1. 一种大吴风总黄酮微波辅助双水相萃取工艺，其特征在于，包括如下步骤： 1) 大吴风粗提液的提取 选取大吴风，粉碎，称取大吴风粉末，按1:30-35( g:mL)料液比，加入提取剂体积分数 为60%-70%的乙醇溶液，20-30°C下，对混合液微波处理20-25min，然后置于60°C恒温水浴 锅中浸提1-1. 5h，离心，取上清液，得到粗提液； 2) 双水相萃取 将步骤1)得到的粗提液，加入C2H5OH- (NH4) 2S04形成的双水相体系，所述C 2H50H的质量 分数为20%-28%，所述（NH4)2SO4的质量分数为16%-24%，加入质量分数为1. 5%-3%的NaCl， 调节pH值为6-8,混勾，分相； 3) 减压蒸馏、干燥 取出富含大吴风总黄酮的乙醇上相，进行减压蒸馏、浓缩溶液，然后将浓缩液进行真空 干燥，得到大吴风总黄酮。2. 根据权利要求1所述的一种大吴风总黄酮微波辅助双水相萃取工艺，其特征在于， 所述步骤2)中包含有质量分数为0. 3-0. 5%的羟丙基-P -环糊精。3. 根据权利要求1或2所述的一种大吴风总黄酮微波辅助双水相萃取工艺，其特征在 于，所述大吴风粗提液在双水相体系中的质量分数为1〇%_19%。4. 根据权利要求1或2所述的一种大吴风总黄酮微波辅助双水相萃取工艺，其特征在 于，所述分相温度为15_35°C，分相时间为2-4小时。5. 根据权利要求1或2所述的一种大吴风总黄酮微波辅助双水相萃取工艺，其特征在 于，所述的真空干燥的温度为60-80°C。6. -种如权利要求1或2所述的种大吴风总黄酮微波辅助双水相萃取工艺得到的大吴 风总黄酮在制备抑菌产品中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种大吴风总黄酮微波辅助双水相萃取工艺，其包括如下步骤：通过微波辅助提取大吴风得到粗提液，粗提液经C2H5OH-(NH4)2SO4形成的双水相体系萃取，得到大吴风总黄酮。本发明使茼蒿总黄酮的提取率变高，杂质成分的提取率变低，使最终得到的大吴风总黄酮的纯度和收率显著提高。
【IPC分类】A61K36/28, A61P31/04
【公开号】CN105030867
【申请号】CN201510399987
【发明人】陈建中, 葛水莲
【申请人】邯郸学院
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月8日