[0273] 细胞内细胞因子或Foxp3的免疫荧光染色
[0274] (1)所有细胞（约5-10X IO5)用PBS洗一遍后，都用抗小鼠CD16/CD32抗体封闭 lOmin，冰上，每管30 y 1体系。
[0275] (2)先进行细胞表面分子的染色，方法参照11. 1.
[0276](3)FACS缓冲液洗一遍后，每管各加入Fixation/Permeabilization buffer 100y 1，放4°C固定过夜。
[0277](4) 400 X g，离心5min，加入I XPermeabilization buffer 200 U 1，混勾。
[0278] (5) 400 X g,离心5min，加入相应的细胞因子抗体或者Foxp3抗体（抗体用 I XPermeabilization buffer稀释），每管50 U 1体系，放冰上避光染色1小时。
[0279] (6)直接加入I XPermeabilization buffer 200 U 1，混勾，400 X g,离心5min〇
[0280](7)弃上清后，再加入I XPermeabilization buffer 200 U 1，混勾，400 X g离心 5min〇
[0281] (8)弃上清后，再加入FACS buffer 200 y 1，混勾，400Xg,离心5min。细胞沉淀 用FACS buffer 200 y 1重悬，即可用流式细胞仪检测分析。
[0282] 数据处理和统计学分析
[0283] 所示实验结果中每个处理组都设置有三个或三个以上的重复，通过Graphpad Prism 5软件作图，图中所示数据以平均数土标准差表示。数据的统计分析采用Student's t检验或单因素方差分析。显著性水准定为a = 〇? 05, *代表p〈0. 05 ;**代表p〈0. 01 ;*** 代表P〈〇. 001。
[0284] 实施例1 IL-17能够增强MSC的免疫抑制功能
[0285] 已有研究表明，间充质干细胞的免疫抑制能力不是固有的，而是在炎症细胞因子 的诱导下获得的，这些炎症细胞因子包括IFNy、TNFa、IL-Ia和IL-IP。间充质干细胞 在炎症细胞因子IFNY和TNFa的刺激下，分泌大量的iNOS和趋化因子，趋化因子招募T 细胞至间充质干细胞的周围，由iNOS的代谢产物NO发挥抑制T细胞增殖的作用。众所周 知，IL-17是一种多效的促炎症细胞因子，它在很多感染性疾病、炎症性疾病和自身免疫病 的发病过程中发挥了重要作用。本发明人向体外培养的间充质干细胞中加入炎症细胞因子 IFNy和TNFa，或在此基础上再加入IL-17,观察这些细胞因子对间充质干细胞免疫抑制 能力的影响。本发明人发现，只有在IFNy和TNFa存在的情况下，间充质干细胞才获得对 T细胞增殖的抑制能力；而IL-17则能够显著增强IFNy和TNFa所诱导的间充质干细胞 的免疫抑制能力，这一作用表现为T细胞增殖明显降低（图1A)。
[0286] 以往的研究已经证明，IL-17是通过与细胞表面的IL-17RA和IL-17RC组成的异 二聚体结合进而激活下游信号通路的。既然IL-17可以作用于间充质干细胞并显著增强其 免疫抑制能力，本发明人检测了间充质干细胞的IL-17RA和IL-17RC的表达情况。结果显 示，间充质干细胞可以组成性地表达IL-17RA和IL-17RC (图1B，C)。
[0287] 在炎症反应的不同阶段，炎症细胞因子的水平是不同的，因此本发明人研究了不 同剂量的IFN Y和TNF a对IL-17的这一增强免疫抑制的功能是否有影响。本发明人发现， 当IFNy和TNFa的水平仅有l-2ng/ml时，IL-17即可以明显增强间充质干细胞的免疫抑 制功能（图1D，4E)。即使当IFNy和TNFa的水平很高时（10-20ng/ml)，IL-17仍可以改 善间充质干细胞的免疫抑制功能。本发明人也观察了不同剂量的IL-17对其增强间充质干 细胞的免疫抑制能力这一特性的影响。结果显示，大约〇. 5ng/ml的IL-17即可明显地增强 间充质干细胞的免疫抑制功能（图1F)。
[0288] 为了进一步明确在T细胞介导的免疫反应中IL-17是否参与MSC对T细胞增殖 的抑制作用，本发明人将MSC与anti-CD3激活的脾细胞共培养，并向共培养体系中加入 anti-IL-17A抗体。结果显示，MSC可以明显地抑制激活的脾细胞的增殖，而anti-IL-17A 抗体可以在很大程度上恢复激活的脾细胞的增殖，逆转MSC的抑制作用（图1G)。当MSC 和脾细胞的比例为1:40时，anti-IL-17A的这一逆转作用最为显著；当MSC和脾细胞的比 例为1:20时，虽然anti-IL-17A的逆转作用减弱了，但仍有统计学意义。总之，本发明人的 研究表明，在T细胞介导的免疫反应中，特别是免疫微环境中存在的炎症细胞因子IFN Y和 TNF a水平较低时，IL-17可以显著增强MSC对T细胞的免疫抑制功能。
[0289] 为了扩展本发明人的研究，本发明人在脂肪来源的MSC上也检测了 IL-17对其免 疫抑制功能的影响作用，得到了与骨髓来源的MSC类似的结果（图1H)，即IL-17同样可以 增强脂肪来源MSC的免疫抑制功能，这提示着IL-17的这一功能可能不依赖于MSC的来源。
[0290] 图1显示了 IL-17增强MSC的免疫抑制功能。
[0291] (A).首先将MSC用细胞因子IFNy、TNFa和IL_17(每种因子的浓度均为2ng/ml) 的不同组合刺激12小时，然后将之与T cell blasts共培养（MSC与T cell blasts的比 例为1:20)，12小时后，用3H-Tdr掺入法测定T细胞增殖。（B).运用实时荧光定量PCR的 方法检测IL-17RA和IL-17RC在MSC和Raw264. 7细胞（阳性对照）上的表达。（C) ?运用 流式细胞术检测MSC表面IL-17RA的表达。（D和E).首先将MSC用细胞因子IFN y +TNF a 或IFN y +TNF a +IL-17刺激12小时（其中IFN y和TNF a的浓度作梯度稀释，IL-17浓度 固定为l〇ng/ml)，然后将之与T cell blasts (需加入IL-2方可增殖，且增殖中不产生炎症 细胞因子）。（D)或Al. 1细胞（T细胞杂交瘤细胞，能自主增殖，且增殖中不产生炎症细胞 因子，该细胞的制备方法可参考文献（Nature. 1989Jun22 ;339 (6226) :625-6.) (E)共培养， MSC和T细胞比例为1:20,12小时后，用3H-Tdr掺入法测定T细胞增殖。（F).首先将MSC 用细胞因子IFN y +TNF a或IFN y +TNF a +IL-17刺激12小时（其中IFN y和TNF a的浓度 固定为2ng/ml，IL-17浓度作梯度稀释），然后将之Al. 1细胞共培养，MSC和T细胞比例为 1:10,12小时后，用3H-Tdr掺入法测定T细胞增殖。（G) ?将MSC与anti-CD3和anti-CD28 激活的脾细胞按1:40或1:20的比例进行共培养，或在培养基中加入anti-IL-17A，48小时 后，用 3H-Tdr掺入法测定脾细胞增殖。⑶.首先将BMMSC或ADSC用细胞因子IFN Y +TNF a 或IFNy+TNFa +IL-17(每种因子的浓度均为10ng/ml)刺激12小时，然后将之与Al. 1细 胞共培养（MSC与Al. 1的比例为1:10)，12小时后，用3H-Tdr掺入法测定T细胞增殖。结 果表示为平均数土标准差，BMMSC :骨髓来源的MSC ;ADSC :脂肪来源的MSC。所示数据代表 三次实验的结果。
[0292] 实施例2IL-17增强MSC免疫抑制的特性依赖于iNOS的活性
[0293] 以上的结果显示，IL-17可以显著增强MSC对T细胞增殖的免疫抑制功能，接下来 本发明人进一步研究了其中的相关机制。之前的研究认为，IL-17可以促进人MSC的增殖。 因此，本发明人首先研究了 IL-17是否通过影响MSC的增殖进而影响其免疫抑制功能。本 发明人将MSC用IFN y +TNF a或IFN y +TNF a +IL-17刺激24小时，然后检测MSC的增殖情 况。本发明人发现，在受到IFNy和TNFa刺激的同时，IL-17的加入反而能抑制MSC的增 殖（图2A)。因此，IL-17并非通过影响MSC的增殖来增强其免疫抑制能力。
[0294] 本发明人之前的研究表明，iNOS是介导小鼠MSC发挥免疫抑制的重要分子。本发 明人检测了 IL-17的这一增强MSC免疫抑制的作用是否依赖于iNOS的活性。结果显示， IL-17的作用能够被iNOS抑制剂L-NMMA完全逆转（图2B)，表明iNOS在其中发挥了至关 重要的作用。
[0295] 图2显示IL-17增强MSC免疫抑制的特性依赖于iNOS的活性。
[0296] (A) ?将 MSC 用细胞因子 IFN y +TNF a 或 IFN y +TNF a +IL-17 (IFN y +TNF a 的浓度 作梯度稀释，IL-17的浓度固定为10ng/ml)处理24小时，然后用3H-Tdr掺入法测定T细 胞增殖。（B).首先将MSC用细胞因子IFNy+TNF a或IFNy+TNFa+IL-17(每种因子的浓 度均为2ng/ml)刺激12小时，然后将之与Al. 1细胞共培养（MSC与Al. 1的比例为1:10)， 或在培养基中加入iNOS抑制剂L-NMMA，12小时后，用3H-Tdr掺入法测定T细胞增殖。所 有数据代表三次独立实验的结果。
[0297] 实施例3 IL-17增强MSC的免疫抑制功能不依赖于对T细胞凋亡的影响
[0298] 以上的研究表明，IL-17可以协同炎症细胞因子IFNy和TNFa增强MSC的免疫 抑制功能，而这一功能主要体现在对T细胞增殖的抑制，并且依赖于iNOS的活性（图1，图 2)。另外，MSC在炎症细胞因子IFNy和TNFa存在的情况下可以诱导淋巴细胞的凋亡，这 一过程也依赖于N0。为了确定IL-17的这一增强MSC免疫抑制的作用是否依赖于对T细胞 凋亡的影响，本发明人将MSC用IFN y +TNF a或IFN y +TNF a +IL-17提前刺激12小时，然 后将之与Al. 1细胞按1:10的比例进行共培养，12小时后收集Al. 1细胞，检测细胞凋亡情 况。本发明人发现，Al. 1细胞在单独培养情况下，凋亡细胞比例低于0. 5% ;而当其与未处 理的MSC共培养后，凋亡细胞的比例明显增加，比例在3-5%;当其与IFNy+TNFa预处理的 MSC共培养时，凋亡细胞的比例进一步增加，比例在7-10% ;A1. 1与IFNy+TNFa +IL-17预 处理的MSC共培养的情况和与IFN y +TNF a预处理的MSC共培养时相似，凋亡细胞的比例 仍在7-10% (图3)。另外，这一现象不依赖于IFN Y和TNF a的浓度，不管IFN Y和TNF a 的浓度在5ng/ml还是lOng/ml，IFN y +TNF a +IL-17预处理的MSC都不能进一步促进T细 胞的凋亡。因此，IL-17增强MSC的免疫抑制不依赖于对T细胞凋亡的影响。
[0299] 图3显示IL-17增强MSC的免疫抑制功能不依赖于对T细胞凋亡的影响。
[0300] 将MSC提前用细胞因子IFN y +TNF a或IFN y +TNF a +IL-17刺激12小时（其中 IFNy和TNFa的浓度为5ng/ml或10ng/ml，IL-17的浓度始终为lOng/ml)，然后按1 :10 的比例与Al. 1细胞共培养，12小时后，收集Al. 1细胞，PI染色后，流式细胞仪分析其DNA 含量。
[0301] 实施例4 IL-17协同炎症细胞因子上调MSC中iNOS的表达
[0302] 之前的研究表明，iNOS和趋化因子是介导MSC免疫抑制功能的核心分子，而且MSC 启动表达iNOS和一些趋化因子需要炎症细胞因子IFNy和TNF a的诱导。本发明人上述结 果显示，IL-17增强MSC免疫抑制的特性依赖于iNOS的活性。本发明人用IFN y +TNF a或 IFN y+TNF a+IL-17来处理MSC，然后用荧光定量PCR和Western Blot的方法来测定iNOS 和趋化因子的表达。结果显示，无论在mRNA水平还是蛋白水平上，IL-17都能够协同IFNy 和TNFa明显促进MSC表达iNOS(图4A，B，C，D)。同时，本发明人也检测了一些和MSC发 挥免疫抑制相关的趋化因子的mRNA表达，包括CCL2、CCL5、CXCL9、CXCL10,结果发现IL-17 并不能协同IFNy和TNFa改变这些趋化因子的表达（图4E)。由此可见，IL-17增强MSC 的免疫抑制特异地依赖于其对iNOS的上调作用。为了进一步验证在T细胞介导的免疫应答 中IL-17对MSC的一些基因表达的上调作用，本发明人将激活的脾细胞上清与anti-IL-17A 孵育一段时间以中和上清中的IL-17,然后用这些上清来刺激MSC，进而检测MSC -些免疫 调苄基因的表达。本发明人发现，激活的脾细胞上清能明显地诱导MSC表达iNOS、CCL2、 CCL5、CXCL9和CXCL10 ;中和了 IL-17的上清则不能很好地诱导MSC表达iNOS (图4F，G)，但 趋化因子CCL2、CCL5、CXCL9和CXCL10的表达则不受影响（图4G)。上述结果表明，IL-17 能够协同IFN y和TNF a明显促进MSC表达iNOS，但却不影响趋化因子CCL2、CCL5、CXCL9 和CXCL10的表达。
[0303] 图4显示IL-17协同炎症细胞因子上调MSC中iNOS的表达。
[0304] (A和E).用IFN Y、TNF a和IL-17 (每种细胞因子浓度均为lOng/ml)几种 细胞因子的不同组合刺激MSC，12小时后收细胞抽提RNA，用Real-Time PCR的方法检 测iNOS、CCL2、CCL5、CXCL9、CXCL10几种mRNA的表达。（B).将MSC用IFNy+TNFa或 IFNY+TNFa+IL-17(每种细胞因子浓度均为lOng/ml)处理指定的不同时间，收细胞提 取蛋白，Western Blot检测iNOS的蛋白表达。（C).将MSC用细胞因子IFNy+TNFa或 IFN y +TNF a +IL-17刺激24小时（其中IFN y和TNF a的浓度作梯度稀释，IL-17浓度固定 为lOng/ml)，收集细胞上清，用Greiss试剂测NO的量。（D).用IFN Y、TNF a和IL-17(每 种细胞因子浓度均为lOng/ml)几种细胞因子的不同组合刺激MSC，24小时后收细胞提取 蛋白，Western Blot检测iNOS的蛋白表达。（F).将MSC用未处理或anti-IL-17A处理过 的激活脾细胞上清刺激24小时，收集细胞提取蛋白，Western Blot检测iNOS的蛋白表达。 (G).将MSC用未处理或anti-IL-17A处理过的激活脾细胞上清刺激12小时，收集细胞提取 RNA，用 Real-Time PCR 的方法检测 iNOS、CCL2、CCL5、CXCL9、CXCLlO 几种 mRNA 的表达。
[0305] 实施例5 Actl是介导IL-17增强MSC免疫抑制作用和相关基因表达的关键分子
[0306] 以往的研究已经证明，IL-17是通过与细胞表面的IL-17RA和IL-17RC组成的异 二聚体结合进而激活下游信号通路的，而在IL-17与IL-17RA、IL-17RC结合后，接头蛋白 Actl与IL-17R的结合是激活IL-17下游信号通路的核心步骤。在下游信号传导中，IL-17 主要通过激活MPK和NF K B通路来实现对靶基因的调节。有报道表明，在Actl基因缺失 的MEF(小鼠胚胎成纤维细胞）中，IL-17的功能和信号传导存在明显缺陷。本发明人建立 了 Actl knockdown稳转细胞及相应的对照细胞，对比研究了两株细胞受到IL-17刺激后 MAPK和NF K B信号通路蛋白磷酸化的变化。与Actl z MEF相似，Actlknockdown MSC在受 到 IL-17刺激后，I K B a、ERK、JNK和p65的磷酸化水平都明显降低，可见IL-17信号传导 明显受到抑制（图5A)。
[0307] 本发明人同时研究了Actl knockdown后，MSC受到IFNy、TNF a和IL-17刺激后 免疫抑制功能和相关免疫调苄基因表达的变化。结果表明，Actl knockdown之后，IL-17不 能有效增加IFN y和TNF a诱导MSC表达iNOS的水平（图5B、C)，同时，IL-17也不能增强 MSC的免疫抑制功能（图OT)。这些可以归因于Actl knockdown之后所引起的IL-17信号 传导的抑制，也进一步佐证了IL-17可以增强MSC免疫抑制功能和基因表达这一发现。
[0308] 图5显示IL-17在MSC中发挥的增强免疫抑制和基因表达