半衰期。（D).将MSC用IFN y +TNF a或IFN y +TNF a +IL-17 (每种细胞 因子浓度均为lOng/ml)进行处理，在加入细胞因子后的指定时间点收集细胞提取蛋白，用 Western Blot检测各时间点AUFl的蛋白表达。
[0333] 实施例11 AUFl是介导IL-17信号转导的关键分子
[0334] 在上述研究中，IL-17不能协同炎症细胞因子IFNy和TNF a上调aufl 7MSC免疫 调苄基因的表达；而相同的现象也在Actl 7MSC中可以观察到（图5)。在IL-17与IL-17 受体结合后激活细胞时，Actl与IL-17受体发生相互作用，从而介导了信号向下游传导， 所以Actl是IL-17信号通路中的关键分子之一。本发明人首先对比了 AUFl knockdown MSC(shAUFIMSC)和其正常对照细胞（shCTRL MSC)受到IL-17刺激后IL-17信号通路中重 要信号分子磷酸化的区别。本发明人发现，在AUFl knockdown的情况下，MSC接受IL-17刺 激后，IL-17信号通路的关键分子p65 (NF K B通路）和ERK (MAPK通路）的磷酸化都明显减 弱（图11A)，提示IL-17信号转导受到抑制，AUFl可能参与了 IL-17的信号传递。
[0335] 为了进一步确认AUFl是否通过与Actl相互作用来参与IL-17的信号传导，本发 明人将MSC用IL-17刺激后收集不同时间点的细胞，通过免疫共沉淀的方法检测了 AUFl和 Actl是否存在相互作用。结果显示，在静息状态下的MSC中，Actl与AUFl有少量结合，而 在IL-17加入后，与Actl结合的AUFl的量明显增多（图11B)。由此可见，AUFl确实通过 与Actl的相互作用参与了 IL-17的信号转导。
[0336] 至此，本发明人得出如下结论：⑴在启动IL-17信号转导过程中，AUFl与Actl相 互作用，从而启动了下游NF K B通路和MAPK通路的活化，进而诱导了靶基因的表达。⑵在 IL-17与其他炎症细胞因子如IFNy和TNFa共同存在的情况下，AUFl则成为IL-17调节 的靶点，IL-17通过降低AUFl的水平来增强目的基因mRNA的稳定性，从而促进基因表达。
[0337] 图11显不AUFl是介导IL-17信号转导的的关键分子。
[0338] (A) ?将 AUFl knockdown细胞（shAUFl MSC)和相应的对照细胞（shCTRL MSC)分别 用IL-17(10ng/ml)处理指定的时间，收集不同时间点的细胞，抽提蛋白，Western Blot方 法检测p-p65、p-ERK蛋白的表达情况。p-代表磷酸化。（B).将MSC用IL-17(10ng/ml)进 行处理，在加入细胞因子后的指定时间点收集细胞提取蛋白，用IgG(对照）或抗小鼠Actl 抗体与蛋白裂解产物进行免疫共沉淀，Western Blot检测Actl和AUF1。
[0339] 实施例12 AUFl是介导IL-17增强MSC治疗CIH效果的关键分子
[0340] 基于AUFl在IL-17发挥增强MSC免疫抑制功能中起到关键作用（图6)。接下 来，本发明人将在CIH模型中验证这一发现。本发明人将WT MSC和auf I7 MSC分别用 IFNy+TNF a、IFNy+TNFa +IL-17预处理12小时，然后给CIH小鼠静脉注射这些不同处理 的细胞，观察疗效。本发明人发现：与之前的结果相符，IL-17可以明显增强WT MSC对于 CIH的疗效，血清ALT水平、肝脏中单个核细胞、CD4+T细胞和CDS+T细胞的数目、肝脏坏死程 度都明显下降。IFNy+TNFa+IL-17预处理的MSC能明显增强WT MSC对CIH的疗效：血清 ALT的平均水平由未处理组的8000U/L降低至2000U/L ;肝脏中单个核细胞由未处理组的 15父105/^1；[￥61'降低至5\105/^1；[￥61';0)4 +1'细胞由未处理组的3\105/^1；[￥61'降低至 lX105/gliver;CD8 +T^Hj]fe*;^#SiJi^3.7X105/glivei^$/fE￡SlX10 5/glive;r。
[0341] 但是对于aufl 7MSC而言，IFNy+TNF a预处理后即可以很好地治疗CIH，而IL-17 的加入也不能增强疗效（图12)。至此，本发明人在体内验证了 AUFl是介导IL-17增强MSC 免疫抑制功能并用于治疗CIH的关键分子。
[0342] 图12显示AUFl是介导IL-17增强MSC治疗CIH效果的关键分子。
[0343] 给小鼠静脉注射ConA (15mg/kg) 30min后，静脉输入不同细胞因子预处理的WT MSC或aufl 7MSC(每组3-5只小鼠，每只小鼠给予5X105个细胞）。7.5小时后，取血，处 死小鼠取肝脏做后续检测。（A).检测血清ALT水平。（B).研磨肝脏后分离单个核细胞并 计数。（C).流式细胞术分析CD4 +和CD8 +T细胞的比例并换算为绝对数目。（D).取一小叶 肝脏做石蜡包埋、H&E染色并拍照，放大倍数为200X。（E).计算（D)图中各组肝脏病理切 片中坏死区域的百分比。结果以平均数土标准差表示。
[0344] 实施例13炎症因子预处理MSCs可以有效治疗肝硬化
[0345]给予C57BL/6小鼠每周灌胃四氯化碳（carbon tetrachloride，CCL4)，连续8周， 以建立肝硬化模型。
[0346] 在肝硬化模型建立的第8周给予小鼠输注不同炎症因子（lOng/ml IFN Y+IOng/ ml TNFa 或 l〇ng/ml IFNy+10ng/ml TNFa +l〇ng/ml IL-17)处理的间充质干细胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)和未处理的MSCs，观察不同处理MSCs对肝硬化的治疗效 果。
[0347]研究发现，给予小鼠诱导肝硬化后，小鼠血清中总胆红素（total bilirubin, TB)、 谷丙转氨酶（alanine aminotrans-ferase， ALT)、谷草转氨酶（aspartate amino-transferase，AST)均显著升高，白蛋白（albumin)水平显著降低。其中，与正 常组小鼠相比，肝硬化模型组小鼠体内的TB水平达到12-15 ymol/L ;ALT水平升高至 1200-1800U/L ;AST水平升高至3500-4500U/L ;白蛋白水平降低至20g/L以下。
[0348] 对肝硬化模型小鼠输注未经处理的MSCs (I X IO6)，可以有效抑制肝硬化小鼠血清 中的TB、ALT、AST的水平，并显著提高白蛋白（albumin)的水平。输注了 MSCs7天后，肝硬 化小鼠血清中TB水平降低了 50-60% ;ALT水平降低约50% ;AST水平降低了 60% ;白蛋白 水平升高了 5%。
[0349]而将炎症因子IFN y +TNF a预处理12小时后的MSCs (I X IO6)，输注到肝硬化小鼠 体内7天后，肝硬化小鼠血清中TB水平降低了约70% ;ALT水平降低了 70-80% ;AST水平 降低了 70%左右；白蛋白水平升高了 20%。显示了更好的肝硬化治疗效果。因此，炎症因 子预处理MSCs可以有效提高MSCs对于肝硬化的治疗作用。
[0350]IFN y +TNF a +IL-17预处理MSCs (I X IO6)，输注到肝硬化小鼠体内7天后，肝硬化 小鼠血清中TB水平降低了 85% ;ALT水平降低了约80-85% ;AST水平降低了约80-90% ; 白蛋白水平升高了 30%。IL-17的加入，表现出了明显的协同作用，可以更为显著的提高 MSCs对肝硬化的治疗作用。
[0351] 讨论
[0352] IL-17对于MSC免疫抑制的增强作用的发现使得本发明人对炎症细胞因子调控 MSC免疫调节能力的研究更深入了一步，同时也为MSC在临床上的应用奠定了基础。在传统 意义上，IL-17是公认的促进免疫应答的炎症因子，很多研究表明IL-17是多种炎症疾病和 自身免疫病的致病因子，包括类风湿性关节炎、多发性硬化和炎症性肠病等。IL-17在许多 自身免疫病病人的血清和组织中呈高现表达，通过使用IL-17中和抗体或敲除IL-17基因， 可以明显缓解这些自身免疫病的症状。尽管如此，IL-17并不是在所有的病理情况下都能 促进免疫应答。比如，在DSS(葡聚糖硫酸钠）诱导的小鼠肠炎模型中，IL-17中和抗体的 应用或敲除IL-17基因反而会加速疾病进程。然而，这一现象相关的分子机制至今还未完 全阐明。本发明人的研究表明在MSC存在的情况下，IL-17可以发挥免疫抑制作用，而当本 发明人用中和抗体去除MSC-T细胞共培养体系中的IL-17时，MSC的免疫抑制功能会受损。 本发明人的这些发现为在病理生理条件下研究IL-17的作用提供了新的思路和方向。
[0353] ConA诱导小鼠肝损伤（CIH)是一个很经典的模拟人病毒性或自身免疫性急性肝 炎的动物模型。在这一模型中，急性免疫应答在介导肝损伤中发挥了主导作用。多种免疫细 胞（T淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞）和免疫分子（细胞因子IFN Y、TNF a、IL-10、IL-22、 IL-25等）都参与了 CIH的病理过程。抑制免疫应答可以很有效地治疗CIH。在本论文中， 本发明人采用了小鼠骨髓来源的MSC，并尝试将IL-17增强MSC免疫抑制这一特性应用到 其对CIH的治疗上。结果发现，未处理的MSC对CIH的治疗效果较差。这主要是因为MSC 对T细胞的免疫抑制作用依赖炎症细胞因子的刺激，虽然在CIH疾病进展中存在多种细胞 因子包括IFNy和TNFa，但是这些细胞因子只能在很短时间内保持较高的浓度，不足以赋 予MSC很强的免疫抑制能力；然而IFN y、TNF a和IL-17三者预处理的MSC可以体现最佳 的治疗效果，这一现象与本发明人在体外实验中得出的结论相符。IL-17对MSC治疗CIH的 增强作用依赖于IL-17加入后增加MSC表达大量的iNOS，对于iNOS / MSC而言，即使提前用 IFNy、TNFa和IL-17三者预处理，也不能使其有效地治疗CIH。因此，本发明人在体内实 验中同样验证了 IL-17增强免疫抑制这一发现。
[0354] 本发明人的研究显示，AUFl的敲除可以促进MSC中IFNy和TNFa诱导的iNOS 的表达，提示了 AUFl对MSC中基因表达调控的重要性。为了进一步揭示IL-17上调MSC基 因表达的分子机制，本发明人检测了 IL-17对iNOS mRNA稳定性的影响，结果显示IL-17可 以显著增强正~丫和了即<1诱导的1勵3 1111?熟稳定性。当4耶1不存在或被敲低后，11-17 不能协同IFNy和TNFa增强iNOS基因表达，也不能进一步增强iNOS mRNA稳定性。体 外免疫抑制实验显示，aufl 7MSC只需要IFNy和TNFa存在即可发挥最强的免疫抑制能 力，不需要IL-17的补充。本发明人进一步研究了 AUFl在IL-17增强MSC中基因表达的具 体机制，结果发现MSC在受到IFNy和TNF a刺激的同时，IL-17的加入可以降低AUFl的 表达水平，这一发现揭示AUFl参与了 IL-17对MSC相关基因表达的调控，也就是说，IL-17 通过降低AUFl的水平进而促进iNOS mRNA的稳定性。免疫共沉淀结果还显示，IL-17刺激 后15min，AUFl和Actl的相互作用明显增强。本发明人还研究了 AUFl knockdown MSC中 IL-17信号通路蛋白激活的变化，结果显示AUFl被敲低后，IL-17信号通路中的p65、ERK等 蛋白的磷酸化明显下降，这提示着AUFl敲低使得IL-17信号转导受损。这些数据表明，AUFl 在IL-17增强MSC基因表达中起着双重作用：AUFl对IL-17启动信号传导是必需的；而在 IL-17与其他细胞因子协同作用时，AUFl同样又是IL-17的靶标，IL-17通过降低AUFl的 水平来促进相关mRNA的稳定性。因此，本发明人首次发现了 AUFl在介导IL-17增强免疫 抑制基因表达中的重要作用，为进一步阐明IL-17作用的分子机制奠定了基础。
[0355] 综上，本发明人的研究第一次揭示了 IL-17可以增强MSC的免疫抑制功能。IL-17 的这一作用主要是通过逆转RNA结合蛋白AUFl降解mRNA的作用来实现的。本发明人相信 IL-17调节MSC免疫抑制的深入研究将有利于MSC更好地应用于临床。
[0356] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种白介素-17、白介素-17的衍生物或其激动剂的用途，其特征在于，用于制备制 剂或试剂盒，所述制剂或试剂盒用于： (1) 提高间充质干细胞的免疫抑制功能；和/或 (2) 上调MSC中免疫抑制因子的表达；和/或 (3) 增强MSC中免疫抑制因子的mRNA的稳定性；和/或 (4) 降低RNA结合蛋白AUFl的表达水平；和/或 (5) 抑制T细胞的增殖；和/或 (6) 治疗肝炎或肝损伤。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述白介素-17是哺乳动物的白介素-17。3. -种白介素-17拮抗剂的的用途，其特征在于，用于制备制剂或试剂盒，所述制剂或 试剂盒用于： (1) 降低间充质干细胞的免疫抑制功能；和/或 (2) 下调MSC中免疫抑制因子的表达；和/或 (3) 降低MSC中免疫抑制因子的mRNA的稳定性；和/或 (4) 增强RNA结合蛋白AUFl的表达水平；和/或 (5) 促进T细胞的增殖。4. 一种组合物，其特征在于，所述组合物包括白介素-17或其衍生物、IFNy和TNFa。5. -种分离的MSC细胞群，其特征在于，所述MSC细胞群由MSC细胞构成或基本上由 MSC细胞构成，并且所述的MSC细胞具有增强的抑制T细胞增殖的能力， 并且，所述的MSC细胞选自下组： (1) 体外经预处理的MSC细胞群，其中所述预处理指用⑴白介素-17或其衍生物、 (ii)IFNy和（iii)TNFa同时、依次或先后进行处理； (2) Actl蛋白过表达和/或AUFl蛋白缺失或活性降低的细胞群；和 (3) 体外经预处理的MSC细胞群，其中所述预处理指用IFNy和TNFa同时、依次或先 后进行处理； (4) 组（1)、组⑵和组⑶的组合。6. -种遗传改造的细胞株，其特征在于，所述细胞株是经基因工程改造从而导致内源 的Actl蛋白过表达和/或AUFl蛋白缺失或活性降低。7. -种分离的蛋白复合物，其特征在于，所述蛋白复合物为Act 1蛋白和AUFl蛋白结合 的蛋白复合物。8. 如权利要求7所述蛋白复合物的应用，其特征在于，所述用途为用于筛选药物或化 合物，所述药物或化合物促进或抑制Actl蛋白和AUFl蛋白形成所述的复合物。9. 一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有以下组分： (a) 白介素-17或其衍生物； (b) IFNy ;和 (C)TNFa ; 以及使用说明书， 其中，所述的组分（a)、（b)和（c)分别位于一个或多个不同的容器或位于同一容器中。10. -种药盒，其特征在于，所述药盒中包括如权利要求4所述的药物组合物和说明 书，所述说明书中记载该药物组合物用于： (1) 提高间充质干细胞的免疫抑制功能；和/或 (2) 上调MSC中免疫抑制因子的表达；和/或 (3) 增强免疫抑制因子的mRNA的稳定性；和/或 (4) 降低RNA结合蛋白AUFl的表达水平；和/或 (5) 抑制T细胞的增殖；和/或 (6) 治疗肝炎或肝损伤。11. 一种治疗肝炎或肝损伤的方法，其特征在于，所述方法包括步骤： 给需要的对象施加治疗有效量的MSC细胞。
【专利摘要】本发明提供了IL-17在提高间充质干细胞免疫抑制功能中的应用。具体地本发明提供了一种白介素-17、白介素-17的衍生物或其激动剂用于制备制剂或试剂盒的用途，用于提高间充质干细胞的免疫抑制功能；上调间充质干细胞中免疫抑制因子的表达；增强免疫抑制因子的mRNA的稳定性；降低RNA结合蛋白AUF1的表达水平；抑制T细胞的增殖；治疗肝炎或肝损伤。
【IPC分类】A61K38/20, A61P1/16, A61P37/06, G01N33/68, C12N5/0775, C07K19/00, A61P31/12, A23L1/29, C12N5/10
【公开号】CN105079792
【申请号】CN201510216007
【发明人】时玉舫, 韩晓燕, 王莹
【申请人】中国科学院上海生命科学研究院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年4月29日
【公告号】WO2015172659A1