Tat-nr2b9c的冻干制剂的制作方法
【专利说明】TAT-NR2B9C的冻干制剂
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 相关申请为2012年11月28日递交的申请号为61/730, 952的非临时申请，出于 所有目的，该申请的全部内容通过引用并入本申请中。
[0003] 序列表的引用
[0004] 序列表命名为427409SEQLIST. txt，共有16千字节，创建于2013年11月20日，该 序列表通过引用并入本申请中。
【背景技术】
[0005] Tat-NR2B9c (NA-I)是一种抑制PSD-95的试剂，从而破坏PSD-95与N-甲基-D-天 冬氨酸受体（NMDARs)和神经元型一氧化氮合酶（nNOS)的结合，以及降低由脑缺血诱发的 兴奋毒性。治疗可减少梗塞体积和功能缺失。TAT-NR2B9c (NA-I)已通过了成功的II期试 验（参见 WO 2010144721 和 Aarts 等，Science 298,846-850(2002) ;Hill 等，The Lancet Neurology, 11:942-950(2012))〇
[0006] 由于TAT-NR2B9c无严重的副作用，在疑似中风或其他缺血性或出血性状况但还 尚未根据领域已认可的标准作出确认不存在出血的诊断时可以施用TAT-NR2B9C。例如， TAT-NR2B9c可在发生中风或神经创伤发生地点被施用（比如患者家中）或在运送受试者去 往医院的救护车上被施用。
【背景技术】
[0007]
[0008] 本发明提供了一种预冻干制剂（prelyophilized formulation)，所述预冻干制剂 包含了4!'-冊289(：(3￡〇10勵:6)、组氨酸和海藻糖，其？11为6-7。所述了41'-冊289(3的浓度 为70-120mg/ml，所述组氨酸的浓度为15-100mM，以及所述海藻糖的浓度为80-160mM。可选 地，所述TAT-NR2B9C的浓度为70-120mg/ml，所述组氨酸的浓度为20-100mM，以及所述海藻 糖的浓度为100_140mM。
[0009] 可选地，所述TAT-NR2B9c的浓度为70-120mg/ml，所述组氨酸的浓度为20-50mM， 以及所述海藻糖的浓度为100_140mM，所述pH为6-7。可选地，所述组氨酸的浓度为20mM， 所述海藻糖的浓度为100_200mM，优选为120mM，以及所述TAT-NR2B9c的浓度为90mg/ml。
[0010] 本发明进一步提供了一种通过将任一上述预冻干制剂冻干而制备的冻干制剂。
[0011] 本发明进一步提供了一种复原制剂（reconstituted formulation)，所述复原制 剂通过将上述冻干制剂和水溶液结合而制得。可选地，所述水溶液为水或生理盐水。可选 地，所述复原制剂的体积是所述预冻干制剂的体积的3-6倍。
[0012] 本发明进一步提供了一种复原制剂，所述复原制剂包含浓度为15_25mg/ml的 TAT-NR2B9C，浓度为4-20mM的组氨酸以及浓度为20-30mM的海藻糖，其pH为6-7。
[0013] 本发明进一步提供了一种制备制剂的方法，该方法包括室温下将此处所述的冻干 制剂样品储存至少一周；以及复原所述冻干制剂。所述方法可进一步包括对患者施用所述 复原制剂，可选地，所述复原制剂在生理盐水中进一步稀释后施用。可选地，所述患者患有 中风或CNS创伤。可选地，所述冻干样品被储存在救护车上。可选地，所述患者患有蛛网膜 下腔出血。可选地，所述患者正在接受动脉瘤腔内修复术。
【附图说明】
[0014] 图1:该图显示了经不同的NA-I制剂治疗后，3PV0中风后的大鼠的脑梗塞面积。
[0015] 图2A，B :A)柱状图显示了不同的NA-I制剂在-20°C和40°C下的稳定性。Y轴表示 在储存温度下储存一周后的NA-I的纯度，该纯度使用RP-HPLC测定，以总面积％表示。B) 与A相同的数据，但按缓冲液和pH归类。
[0016] 图3:该柱状图显示了在不同的填充剂和盐的存在下，在pH6. 5的组氨酸缓冲液中 的20mg/ml NA-I在-20°C和40°C下的稳定性（通过HPLC测定）。
[0017] 图4A，B:在甘露醇（A)或甘露醇和NaCl (B)的存在下，在pH6. 5的组氨酸缓冲液 中的 20mg/ml NA-1 的差不扫描量热法（Differential scanning calorimetry)分析图。
[0018] 图5A，B:在海藻糖（A)或海藻糖和NaCl⑶的存在下，在pH6. 5的组氨酸缓冲液 中的20mg/ml NA-I的差示扫描量热法分析图。
[0019] 图6A，B :在右旋糖酐-40 (A)或右旋糖酐-40和NaCl (B)的存在下，在pH6. 5的组 氨酸缓冲液中的20mg/ml NA-I的差示扫描量热法分析图。
[0020] 图 7A, B :A) 3mL 在 pH 为 6. 5 的 IOOmM 组氨酸和 120mM 海藻糖中的 90mg/ml NA-I 冻干后的蛋糕状外观。B)具有不同含量的组氨酸和海藻糖的选择性的NA-I制剂的蛋糕状 外观。
[0021]
[0022] 除了活性试剂，冻干制剂还包括一种或多种下列种类的成分。所述种类不是相互 排斥的，换句话说，相同的试剂成分可能属于多个种类。
[0023] "填充剂"为冻干肽提供了结构。所述填充剂包括：甘露醇、海藻糖、右旋糖酐-40、 甘氨酸、乳糖、山梨醇和蔗糖等。除了提供药物上美观的蛋糕状，填充剂也会在改善（蛋糕 状）塌陷温度，提供冻干保护、玻璃化转变温度以及增强蛋白长期储存稳定性方面提供有 益的效果。这些试剂也可用作渗透压调节剂（tonicity modifiers)。
[0024] 缓冲液是一种在冻干前将溶液pH维持在可接受的范围内的试剂。优选的缓冲液 为组氨酸。其它的缓冲液包括琥珀酸盐（钠或钾），组氨酸，柠檬酸盐（钠），葡糖酸盐，醋 酸盐，磷酸盐，Tris等。优选的缓冲液在约5. 5至7或约6至7. 7的pH范围内有效，优选 pH为约6. 5。将pH控制在该范围内的缓冲液实例包括琥珀酸盐（比如琥珀酸钠）、葡糖酸 盐、组氨酸、柠檬酸盐和其它的有机酸缓冲液。
[0025] "冷冻保护剂（cryoprotectant) "为肽提供稳定性以抵挡冷冻诱导的应力，推测应 力是从蛋白表面优先排除的。该试剂也可在初级和次级干燥期间及产品长期储存期间内提 供保护。冷冻保护剂的实例为：聚合物，例如右旋糖酐和聚乙二醇；糖类，例如蔗糖、海藻糖 和乳糖；表面活性剂，例如聚山梨醇酯；以及氨基酸，例如甘氨酸、精氨酸和丝氨酸。
[0026] 在干燥或脱水过程（初级和次级干燥周期）中，冻干保护剂（Iyoprotectant)为 肽提供了稳定性，推测是通过提供无定形的玻璃状基质，以及通过氢键与蛋白结合，取代干 燥过程中被除去的水分子而提供稳定性的。这有助于维持肽的构象，使肽在冻干周期的降 解最小化，提尚广品的长期稳定性。实例包括多兀醇或糖，例如庶糖和海澡糖。
[0027] 上文中尚未提到的是，其它的稳定剂或降解抑制剂也可包括脱酰胺作用抑制剂、 表面活性剂，一些常见的为聚乙氧基失水山梨醇（sorbitan polyethoxylates)脂肪酸酯 (例如：聚山梨酯20或聚山梨酯80)/泊咯沙姆188和洗涤剂。
[0028]术语"冻干（Iyophilization) "、"冻干的（Iyophilized) " 和"冷冻干 (freeze-dried) "涉及一种工艺，通过该工艺，待干燥的原料先被冷冻，然后在真空环境下 升华而去除冰或冻结的溶剂。
[0029]"药物制剂（pharmaceutical formulation) "或组合物为一种制剂，该制剂使得活 性试剂有效，而且对将要被施用该制剂的受试者没有有毒的附加组分。
[0030]"复原时间（Reconstitution time) "是用溶液将冻干制剂再水化为肉眼看不到微 粒的溶液所需的时间。
[0031]"稳定的"冻干肽制剂是在20°C下观察至少1个星期、1个月，或者更优选为至少 3个月、至少6个月或一年而无显著变化的制剂。如果通过SEC-HPLC测定，不超过10%、 优选为不超过5%的肽被分解，则认为变化不显著。通过视觉分析，上述再水化的溶液是无 色的或清澈的至呈淡淡的乳白色。所述制剂的浓度、PH以及渗透压在储存后的变化不超 过+/-10 %。（制剂的）效力为新近制备的对照样品的70-130 %，优选为80-120 %，或有 时为80-100%的范围之内。可观察到不超过10%，优选为不超过5%的碎肩。形成了不超 过10%，优选为不超过5%的聚集物（aggregation)。可通过多种在Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed. , Marcel Dekker, Inc. , New York, N. Y. , Pubs. (1991)以及 Jones, A. Adv.Drug Delivery Rev. 10:29-90(1993)中讨论的方法来测定稳定 性。
[0032] 术语"等渗（isotonic)"是指目标制剂与人体血液具有基本相同的渗透压。 等渗制剂通常具有约270-328m0sm的渗透压。稍低渗压为250-269m0sm，稍高渗压为 328-350m0sm。渗透压可以测量，例如，使用蒸汽压渗压计或冰冻型渗压计（ice-freezing type osmometer)〇
[0033] 渗透压调节剂：盐（NaCl、KCl、MgCl2、CaCl 2)可用作渗透压调节剂从而调控渗透 压。此外，冷冻保护剂/冻干保护剂和/或填充剂也可用作渗透压调节剂，例如，蔗糖、甘露 醇或甘氨酸。
[0034]例如浓度或pH的数值在反应测量该值时的精确度的误差范围内给出。除非文中 另有要求，部分数值舍入至最接近的整数。除非文中另有要求，数值范围的详述意味着可使 用该范围内的任何整数或子范围。
【具体实施方式】
[0035] I ?概述
[0036] 本发明提供了活性试剂的冻干制剂，尤其是TAT-NR2B9C的冻干制剂。这样的制剂 在室温下是稳定的，从而方便维持该种制剂在救护车等场所的供给，或者方便应急人员在 疾病或事故现场或介于此类现场与医疗设施之间的场所施用该制剂。
[0037] 冻干制剂由预冻干制剂制备而来，所述预冻干制剂包含活性试剂、缓冲液、填充剂 和水。其他的组分，例如，低温保护剂或冻干保护剂，张度剂（tonicity agent)药学上可 接受的载体等可能存在也可能不存在。优选的活性试剂为TAT-NR2B9c。优选的缓冲液为 组氨酸。优选的填充剂为海藻糖。海藻糖还可以作为低温或冻干保护剂。预冻干制剂的 示范例包含活性试剂（例如，TAT-NR2B9c)、组氨酸（10-100mM、15-100mM、15-80mM、40-60mM 或 15-60mM，如 20mM，或可选为 50mM 或 20-50mM)和海藻糖（50-200mM，优选为 80-160mM、 100-140mM，更优选为120mM)。pH为5. 5-7. 5,较优选为6-7,更优选为6. 5。所述活性试 剂（例如，TAT-NR2B9C)的浓度为 20-200mg/ml，优选为 50-150mg/ml，更优选为 70-