了 l〇°C。但是，在60°C时，组合的稳定性介于单独的海藻糖和单独右旋 糖酐样品之间，所以海藻糖为优选的填充剂。
[0176] 冻干NA-I制剂的制备：小型实验#2
[0177] 将小批量的NA-I药品冻干以评估初级干燥期间将搁板温度设置为5°C的情况。以 27mg/mL的活性浓度将NA-I混合在pH6. 5的50mM组氨酸和120mM海藻糖中。周期参数如 表17所示。4个20mL的玻璃冻干瓶被装入了 IOmL混合液。使用温度探针对两个小瓶进行 探测。
[0178] 表17 :小型实验2，NA-1制剂的制备
[0179]
[0181]1初级干燥温度是基于大的瓶尺寸和填充体积，与玻璃化转变温度不直接关联。
[0182] 由于大的填充体积，则需要将搁板温度设置得比玻璃化转变温度暖得多，以弥补 蒸发冷却。初级干燥期间的溶液温度为-29°C，该温度接近由DSC热分析得出的玻璃化转变 温度_28°C。
[0183] 低压冻干的90mg/mL NA-I的加速稳定性（小型实验3)
[0184] 在配制小型实验3的填充溶液之前，测定在缓冲液（50mM组氨酸，pH 6. 5)中的 90mg/mL NA-I的pH。所述溶液的pH为6. 04。确定的是随着NA-I浓度的增大，缓冲能力也 需要增强。在150mM、IOOmM和75mM的组氨酸缓冲液中以及水中制备溶液，并测定pH。pH 如表18所示。在pH 6. 5的IOOmM组氨酸缓冲液中配制小型实验3溶液，在加入NA-I之后 重新调整pH至6. 5。
[0185] 表18 :pH，90mg/mLNA-I在pH 6.5的组氨酸缓冲液中
[0186]
[0187] 将小批量的NA-I药品冻干，以评估其在25°C和60°C下储存一周后的固体稳定性。 配制两种90mg/mL的NA-I制剂（缓冲液和带有海藻糖的缓冲液）。对t= 0和t= 1周时 的样品进行外观、复原、含水量以及纯度（纯度用HPLC(MSA方法）测定）方面的评估。
[0188] 所有的NA-I药品都呈白色、冻干蛋糕状。某些蛋糕破裂。无效对照剂与活性制剂 肉眼看起来很相似。
[0189] 相对于前述制剂少于10秒的复原时间，（此处所述）复原时间约为1. 5分钟。复 原时间增加最有可能是因为NA-I和组氨酸的浓度增大引起的。进一步的试验表明，在浓度 为50mM和75mM的组氨酸缓冲液中的NA-I的稳定性良好，且再悬浮时间缩短。另外，由于 本实验采用2mL体积的小瓶，因此低压冻干中仅能加入ImL水。该小型实验配置中的实际 复原体积为4. 5mL。当采用较大的稀释体积时，复原时间最有可能得到改善。
[0190] 将小瓶置于25 °C和60 °C下储存一周后，测定其稳定性。
[0191] 根据肉眼所观察的外观数据，海藻糖样品提供了更优良的蛋糕状。冻干周期保守 地运行超过5天，初级干燥温度为-32°C。基于温度探针数据，该周期可被缩短，这表明随着 浓度增加和填充体积减小，优化周期将会缩短。
[0192] 纯度结果列于表19。
[0193] 表19 :纯度（由HPLC测定的面积％ )，小型实验3
[0194]
[0195] 根据该加速稳定性数据，海藻糖对NA-I制剂显示出稳定效应，所述稳定效应提高 了低压冻干的化学稳定性。令人意外的是，海藻糖能够提供这种稳定效应，而其它的标准填 充剂（例如用于其它肽的右旋糖酐和甘露醇）不能提供这种稳定效应。
[0196] 减少填充体积可使周围小瓶的蒸发冷却最小化，且最大限度地减少水升华的阻 力。
[0197] 冻干周期的进行-小型实验4 (无效对照剂和活性剂）
[0198] 开始冻干周期的小型实验4,以测定3mL填充量时的蛋糕状外观和冻干条件。测试 的样品为带有120mM海藻糖的IOOmM组氨酸（pH 6. 5)和90mg/kg NA-I或者是去除海藻糖 的相同样品。如表20中所述，进行了保守的为期4天的周期。具有3mL填充配制的无效对 照剂和活性剂被加入到20mL的玻璃冻干瓶中，而不是前述实验使用的较小的小瓶。有效温 度探针用于确定冻干周期期间的温度。所得的活性剂小瓶示于图7A。
[0199] 表20 :小型实验4的冻干参数
[0200]
[0201 ] 4天的周期里，浓度为90mg/mL的制剂在20mL的瓶子中形成优良的蛋糕状，温度探 针的数据表明周期可缩短至3天。
[0202] 无效对照剂和活性剂的含水量为0. 01 %和0. 00%。
[0203] 冻干周期的进行-小型实验5 (无效对照剂和活性剂）
[0204] 为了开发适用于临床试验的匹配无效对照剂小瓶（matching placebo vial)和潜 在商业规模下的制剂（270mg/瓶）的再悬浮时间，进行了小型实验5。评估了 10种无效对 照制剂和1种活性制剂的外观和再悬浮时间。活性剂蛋糕为优良的白色蛋糕状，伴有轻微 的收缩，导致瓶壁表面周围有裂纹。无效对照剂蛋糕为白色，含有海藻糖的量越高，裂纹就 越多。
[0205] 使用13. 5mL的水对小瓶（制剂）进行复原。溶解时间列在表21中。低压冻干的 活性剂立刻重新悬浮，但在变为清澈无色的溶液之前活性剂有17. 6秒的浑浊。所有的无效 对照剂都为清澈无色的溶液。
[0206] 表21 :无效对照剂和活性剂的复原（SS5)
[0207]
[0208] 根据上述稳定性、再悬浮时间和冻干时间，NA-I预冻干的优选商用配方为 20-100mM组氨酸、120mM海藻糖，pH为6. 5。在不损失稳定性或蛋糕状的美观性但减少再悬 浮时间的情况下，可增大海藻糖的浓度。
[0209] 通过肉眼观察和悬浮时间检测增加的海藻糖对蛋糕形成和匹配的无效对照剂的 影响
[0210] 为了更好地匹配无效对照剂，在NA-I存在和NA-I不存在，填充体积为3mL或5mL 的情况下，对不同浓度的海藻糖进行测试，。
[0211] 首先，对活性制剂和无效对照制剂进行概述。然后，对3mL填充和5mL填充来说， 将主要的视觉上匹配性状标记出来。目前，分析样品（填充溶液和一种效力样品）正在被 分析。表22和23显示了测试制剂的一部分。
[0212] 表22:活性制剂
[0224] 实施例7:冻干的270mgNA-l在pH6. 5的20mM组氨酸缓冲液和120mM海藻糖中的 稳定性
[0225] 冻干药品的制备
[0226] 在pH6. 5的20mM组氨酸和120mM海藻糖中制备浓度为90mg/mL的小批量NA-I药 品，然后将其冻干以评估所述药品在-20°C、40°C和60°C下储存4周后的固态稳定性。表25 显示了冻干条件。
[0227] 表25 :实施例7的冻干周期条件
[0230] 样品被储存在恒温箱中，在0周、1周、2周和4周后，对13. 2mL(相对于13. 5的最 终体积）（样品）的纯度、效力和复原时间进行评估。各个储存温度和时间的数据示于表 26A-C 中。
[0231] 表26A :-20°C下的稳定性
[0232]
[0240] 1注：主峰周围分辨率损失
[0241] 该NA-I制剂在-20°C下是稳定的。采用MSA HPLC分析发现，对于40°C和60°C的储 存温度，潜在的杂质在相对保留时间（RRT) 1. 07、I. 1和1. 29时缓慢增长，在RRT 1. 07时出 现了最大程度的增长。对于40°C的储存温度，所述杂质在一个月内从0. 09%增长至0. 27%; 对于60°C的储存温度，所述杂质从0.09%增长至0.59%。在-20°C下未观察到杂质。使用 Arrnehius方程发现，25°C下16个月或5°C下123个月后掺入的杂质少于0.5%，室温下超 过60个月以及5°C下多年后掺入的杂质小于2%。因此，该制剂及相关制剂适合于冻干药 品的室温下储存。
[0242] 总结论
[0243] 根据上述稳定性、再悬浮时间以及冻干时间，NA-I的优选商用制剂为20-100mM组 氨酸、120mM海藻糖，pH为6. 5。在不损失稳定性或蛋糕的美观性的情况下，可增大海藻糖 的浓度，但再悬浮时间会随海藻糖浓度增大而增加。
【主权项】
1. 一种预冻干制剂，所述预冻干制剂包含TAT-NR2B9c (SEQ ID N0:6)、组氨酸和海藻 糖，所述预冻干制剂的pH为6-7。2. 根据权利要求1所述的预冻干制剂，其中所述TAT-NR2B9C的浓度为70-120mg/ml， 所述组氨酸的浓度为15-100mM，以及所述海藻糖的浓度为80-160mM。3. 根据权利要求1所述的预冻干制剂，其中所述TAT-NR2B9C的浓度为70-120mg/ml， 所述组氨酸的浓度为20-100mM，以及所述海藻糖的浓度为100-140mM。4. 根据权利要求1所述的预冻干制剂，其中所述TAT-NR2B9C的浓度为70-120mg/ml， 所述组氨酸的浓度为20-50mM，以及所述海藻糖的浓度为100-140mM。5. 根据权利要求1所述的预冻干制剂，其中所述组氨酸的浓度为20mM，所述海藻糖的 浓度为100_200mM，优选为120mM，以及所述TAT-NR2B9c的浓度为90mg/ml。6. -种冻干制剂，通过将权利要求1-5中任一项所述的预冻干制剂冻干而制备。7. -种复原制剂，通过将权利要求6所述的冻干制剂和水溶液结合而制备。8. 根据权利要求7所述的复原制剂，其中所述的水溶液是水或生理盐水。9. 根据权利要求7所述的复原制剂，其中所述复原制剂的体积是所述预冻干制剂体积 的3-6倍。10. -种复原制剂，所述复原制剂包括浓度为15_25mg/ml的TAT-NR2B9C，浓度为 4-20mM的组氨酸，和浓度为20-30mM的海藻糖，所述复原制剂的pH为6-7。11. 一种制备制剂的方法，所述方法包括将权利要求4所述的冻干制剂样品在室温下 储存至少一周；以及复原所述冻干制剂。12. 根据权利要求11所述的方法，进一步包括对患者施用所述复原制剂，可选地，所述 复原制剂在生理盐水中进一步稀释后施用。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述患者患有中风或CNS创伤。14. 根据权利要求11所述的方法，其中所述冻干样品被储存在救护车上。15. 根据权利要求11所述的方法，其中所述患者患有蛛网膜下腔出血。16. 根据权利要求11所述的方法，其中所述患者正在接受动脉瘤腔内修复术。
【专利摘要】本发明提供了活性试剂的冻干制剂，尤其是TAT-NR2B9c的冻干制剂。TAT-NR2B9c对于治疗中风、动脉瘤、蛛网膜下腔出血和其它神经或神经创伤状况具有良好的前景。这种制剂在室温下是稳定的，因此便于维持该制剂在救护车上的供给，以在疾病或事故现场施用或运往医院途中施用。
【IPC分类】A61K38/10, A61K38/08
【公开号】CN105101986
【申请号】CN201380071653
【发明人】乔纳森·戴维·加曼
【申请人】诺诺公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2013年11月25日
【公告号】CA2892965A1, EP2925338A1, US20140162957, WO2014085349A1