生长激素化合物制剂的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本申请涉及生长激素化合物的药用组合物或制剂。
[0002] 背景 生长激素（GH)为由哺乳动物的垂体前叶分泌的多肽激素。依物种而定，GH为包含约 190个氨基酸残基，相当于分子量为约22 kDa的蛋白。GH通过细胞表面受体结合于GH受 体（GHR)并发信号。GH在促进生长、维持正常身体组成、合成代谢和脂质代谢中起着关键作 用。其对于中间代谢也有直接影响，比如减少葡萄糖摄取、增加脂类分解以及增加氨基酸摄 取和蛋白质合成。激素也对包括脂肪组织、肝、肠、肾、骨骼、结缔组织和肌肉在内的其它组 织发挥作用。
[0003] GH分类为呈现"上-上-下-下"拓扑学，具有两个保守的二硫键的四螺旋束蛋 白。具体地讲，成熟的野生型人GH (由SEQ ID NO: 1鉴定为hGH)包含191个氨基酸残基， 并在53、165、182和189位具有4个半胱氨酸残基，其通过形成两个分别连接C53于C165 和C182与C189的分子内二硫键来稳定蛋白的三维结构。
[0004] 重组hGH (促生长激素（somatropin))可作为例如Genotropin? (辉瑞 (Pfizer))、Nutropin?和 Protropin? (基因泰克（Genentech))、Humatrope? (礼来制药 公司（Eli Lilly))、SerostinT (雪兰诺公司（Serono))、Norditropin? (诺和诺德（Novo Nordisk))、Omnitrope? (山德士（Sandoz))、Nutropin Depot? (基因泰克和 Alkermes 公 司（Genentech和Alkermes))市售得到。另外，在N-末端具有另外的蛋氨酸残基的类似物 也作为例如SomatonornT (法玛西亚普强公司（Pharmacia Upjohn)/辉瑞（Pfizer))销售。
[0005] 生长激素用于治疗生长激素缺乏症，但是不幸的是hGH和上面描述的重组形式具 有相对短的半衰期，这意味着接受生长激素治疗的患者一般地需要每天给予生长激素。此 外，由于生长激素为蛋白质，给与形式为注射，这代表对患者日常不便。
[0006] 为了提供更便利的产品，可寻找持续释放制剂，或者作为替代期望提供具有延长 的半衰期的生长激素化合物。
[0007] hGH已经受到广泛的诱变和各种修饰，试图产生其具有改变的化学或生物学性 质的hGH类似物和缀合物，包括蛋白酶稳定化突变体、半胱氨酸突变体以及如在比如US 2003/0162949、W0 02/055532和W006/048777中描述的生长激素的聚乙二醇化变体。
[0008] 寻求具有增加的功能比如增加的半衰期的生长激素化合物目的在于减小所需要 的化合物的量和治疗药物的给予频率。
[0009] 尽管具有增加的半衰期的生长激素化合物可在实验环境下获得和起作用，但是必 须使得患者能够以本文允许安全和便利地使用的制剂获得化合物。
[0010] 概述 本发明在一个方面涉及包含具有延长的半衰期的生长激素化合物，适合于长时间 储存的药用组合物。药用组合物可包含生长激素缀合物，特别是生长激素白蛋白结合体 (binder)缀合物。这种生长激素缀合物的化学性质对于寻找满足来自行业和患者的要求和 愿望的药用组合物的化学家提供了进一步的挑战，例如寻找一种还优选地在室温下可易于 制备、处理和储存的组合物，并且这种组合物允许轻松和不太频繁地按剂量给予。本发明涉 及经长时间的包括振动在内的应力和温度升高保持稳定的药用组合物，这种应力和温度升 高为组合物稳定性的量度。
[0011] 在一个实施方案中，本发明的药用组合物包含生长激素白蛋白结合体缀合物、缓 冲剂、防腐剂和0. 5-5. 0 mg/mL表面活性剂，比如1. 0-3. 0 mg/mL表面活性剂。表面活性剂 可选自泊洛沙姆188和聚山梨醇酯80。药用组合物可进一步包含缓冲剂比如组氨酸，以确 保pH为6. 5-7. 0，优选地为6. 8。在再一些实施方案中，组合物包含防腐剂比如苯酚和/或 等渗剂比如甘露糖醇。
[0012] 生长激素化合物可为包括彼此共价结合（_)的白蛋白结合侧链（AB)和生长激素 蛋白（GH)的，如由式AB-GH代表的生长激素白蛋白结合体缀合物。
[0013] 这种缀合物的实例包括其中AB-经GH中的半胱氨酸残基连接于GH的分子。组合 物的缀合物可用下式描述:A-W-B-Q-GH，其中GH代表生长激素蛋白或变体，A为白蛋白结合 残基，B为（亲水性）间隔基，Q为连接GH和B的化学基团，W为连接B和A的化学基团，和 为共价键。
[0014] 缀合物的浓度可为比如2-15 mg/mL，并且组合物可用于皮下给予比如一周一次， 例如组合物可用于经皮下给予一周一次的治疗方法。
[0015] 本发明的组合物用于生长激素缺乏症或者其中患者得益于循环生长激素的水平 升高的疾病或障碍的治疗方法。
[0016] 在其他的方面，本发明涉及制备本发明的药用组合物、制备用于治疗方法的药用 组合物，并且特别是用于生长激素缺乏症的治疗方法的方法。
[0017] 本发明还涉及生长激素化合物用于制备本发明药用组合物的用途。
[0018] 在一个方面，本发明涉及治疗方法，这种方法包括给予用于治疗生长激素缺乏症 或者其中患者得益于循环生长激素活性的水平升高的疾病或障碍的所述药用组合物。
[0019] 序列表 SEQ ID NO: 1:成熟的 hGH 1-191 (生长激素（Somatotropin))(本文简称为 hGH)
附图简述 图1显示在5°C下，于具有不同pH的缓冲剂中储存90天期间，包含0. 0或3 mg/mL泊 洛沙姆188的药用组合物的HMWP含量。
[0020] 图2显示在具有pH 6. 0的组合物中，以不同浓度包含各种表面活性剂的药用组合 物的HMWP含量。显示了如在5°C下储存90天期间测量的HMWP含量。
[0021] 图3显不在pH 6. 2和6. 8下含有各种量的表面活性剂（泊洛沙姆188)的一系列 组合物的HMWP含量。显示了如在30°C下储存180天期间测量的HMWP含量。
[0022] 图4显示在物理应力（移液和振动）之后，包含各种量的泊洛沙姆（0、1. 0、3. 0 mg/mL)并伴随pH变化（6. 2、6. 5和6. 8)的一系列药用组合物在340 nm下的0D。图A和 B代表相同的数据，但是专注于左轴的不同部分，因为B为低范围的放大以显现低范围的测 量值。
[0023] 图5显示包含不同生长激素化合物的系列药用组合物在340 nm下的0D，所述生长 激素化合物为WT hGH、GH L101C和缀合物I。
[0024] 图6显示在日本受试者（A)和非亚洲受试者⑶的平均IGF-I标准偏差得分。
[0025] 描述。
[0026] 本申请涉及生长激素化合物的药用组合物。本发明的组合物或制剂应能够在生产 期间和在制剂储存期间两种情况下适应生长激素化合物而不造成明显的活性损失、改变或 者以其他方式负面影响生长激素化合物。
[0027] 本发明的一个方面涉及包含生长激素白蛋白结合体缀合物的药用组合物。
[0028] 药用组合物可作为液体组合物制备，其中液体组合物可为比如溶液剂、混悬剂或 乳剂。
[0029] 在再一些实施方案中，这种组合物为包含至少50% w/w水，比如50-80 % w/w，比如 50-70% w/w，比如50-60% w/w水的含水组合物。
[0030] 生长激素白蛋白结合体缀合物 为了适应相对于重组hGH不那么频繁地给予生长激素白蛋白结合体缀合物，缀合物必 须以足够高的浓度配制。缀合物的浓度可以mg/mL或以摩尔浓度描述，由于依白蛋白结合 体侧链而定的分子量变化，对此可能认为后者是更准确的。
[0031] 在本发明药用组合物的一个实施方案中，以2. 0 mg/mL-20. 0 mg/mL比如3. 0-10. 0 mg/mL的浓度包含生长激素白蛋白结合体缀合物。依所需要的剂量而定，可为有利的是能够 储存具有各种浓度的活性成分例如生长激素白蛋白结合体缀合物的药用组合物。在一个实 施方案中，浓度为比如6.0-8. 0 mg/mL或者比如6.0-7. 0 mg/mL。在一个实施方案中，生长 激素白蛋白结合体缀合物的浓度为6. 7 mg/mL。在备选的实施方案中，生长激素白蛋白结合 体缀合物的浓度为2-5 mg/mL，比如2. 5-4 mg/mL。在再一个备选实施方案中，生长激素白 蛋白结合体缀合物的浓度为8-12 mg/mL，比如9-11 mg/mL。在一个优选的实施方案中，药 用组合物的其它组分的组成和浓度保持不变，而仅有生长激素白蛋白结合体缀合物的浓度 进行调整。
[0032] 生长激素白蛋白结合体缀合物通过使白蛋白结合侧链缀合于生长激素蛋白而得 到。生长激素白蛋白结合体缀合物因此可包含彼此共价结合（_)的白蛋白结合侧链（AB) 和生长激素蛋白（GH)，如由式AB-GH代表的那样。白蛋白结合侧链（AB)可包含通过化学实 体（W)连接在一起的白蛋白结合残基（A)和任选的间隔基（B)。连接至生长激素的键可经 化学基团Q。生长激素白蛋白结合体缀合物因此可用扩展的下式描述：GH-Q-B-W-A。在一 个实施方案中，本发明的组合物包含下式的生长激素白蛋白结合体缀合物：GH-Q-B-W-A。
[0033] 对于包括突变或修饰的任何一种生长激素化合物，重要的是考虑与野生型（wt) 生长激素相比较那些变化是否影响活性。多种测试是技术人员可用的，并且对于本申请的 目的，生长激素化合物、蛋白或缀合物全部认为是生物活性的，比如能够刺激生长激素受 体，这可以BAF测定或者以本领域已知并描述于比如W02011/089255中的小鼠或大鼠研究 来测量。应注意与野生型生长激素相比较，在一些测定中活性可能会降低，但是由于分子的 结构变化而增加的半衰期，可能形成反作用，这导致分子具有延长的效果。
[0034] 人生长激素（hGH)本文用于描述如由SEQ ID NO: 1定义的191个氨基酸残基的成 熟的人生长激素蛋白的序列。
[0035] 尽管人生长激素序列中的突变被容忍，但是最小数目的突变为优选，这可表示为 与SEQ ID N0:1的同一性水平。在一个实施方案中，缀合物的GH为与hGH等同至少95%，与 hGH等同比如96%、比如97%、比如98%或比如99%。
[0036] 在再一些实施方案中，缀合物的GH具有与hGH相比较至多4点突变，比如至多3 点突变，与hGH相比较比如至多2点突变或比如恰好1点突变。
[0037] 白蛋白结合侧链与GH的键合可经野生型残基或突变型氨基酸残基。
[0038] 在一个实施方案中，与人生长激素相比较，生长激素（GH)在氨基酸AA 98-105中 的任何一个包含点突变。在一个实施方案中，生长激素（GH)包含Cys突变，其为GH序列中 的半胱氨酸的野生型残基替代。在一个实施方案中，与人生长激素相比较，GH在氨基酸AA 98-105中的任何一个包含Cys突变。
[0039] 在一个实施方案中，生长激素（GH)包括L101C突变。
[0040] 在一个实施方案中，侧链（AB)经环2中的氨基酸残基（L2，AA99-106)或生长激 素变体中的相应残基连接于生长激素。
[0041] 在一个实施方案中，本发明的组合物包含具有下式的生长激素白蛋白结合体缀合 物:A-W-B-Q-GH，其中 GH代表生长激素多肽， A为白蛋白结合残基， B为（亲水性）间隔基， W为连接A和B的化学基团， Q为连接GH和B的化学基团-NH-C (0) - (CH2)-， 和为共价键。
[0042] 在一个这种实施方案中，A-W-B-Q-经GH中的Cys残基连接于GH，其可为引入另外 Cys残基的比如Cys突变。
[0043] 在一个实施方案中，A-W-B-Q-连接于GH的L101C。
[0044] 在再一个实施方案中，A选自：
其中*意指通过W连接于B。
[0045] 在再一个实施方案中，W具有下式:Wa-Wb，其中Wa选自-C(0)NH-、-NHC(0)-、-C(0) NHCH2-、-CH2NHC(0)-、-C(0)NHS(0)2-、-S(0)2NHC(0)-、-0C(0)NH-、-NHC(0)0-、-c(0) CH2-、-CH2C(0)-、-c(0)CH=CH-、-CH=CHC(0) -、- (CH2)-、-c(0)-、-c(0) 0-、-oc(0)-，和 1选 自-CH2-C6H12-C(=0)-、-0EG-、-Lys、-Glu、-y -Glu-、-CH-、-CH- (CH2-S03H)-C(0)-、-S(0)2-(C H2)3-C(0)-或价键。
[0046] _一个实施^中，ff选自铺账删0)_、0(0_-、〇#?：(0)-、铺瞒)。乇(0)卿)-、(￡(0) M~、K〇XK~c(o)〇i-、~afX〇)-、~c(o)aM}K~aMHX〇)-、-(ap-、~c(o)-、~c(〇XK~oc(o)-^^_-t^i^*， W 为-c (0) NH-S (0) 2- (CH2) 3-C (0) _。
[0047] 在一个实施方案中，间隔基B为亲水性间隔基B。B的亲水性增加白蛋白