苯酸。
[0197] 在5 °C下，在90天内，测量来自时间点0、30、60和90天的样品中的HMWP (高分子量 蛋白）的量。在25°C下得到类似的数据。采用TSK凝胶G3000 SWXL柱、磷酸钠/异丙醇pH 7.0流动相，和等度洗脱，并随后在215 nm下进行紫外检测，经尺寸排阻色谱法（SEC-HPLC) 测量HMWP含量。
[0198] 图1显示泊洛沙姆188在制备的时候稳定制剂。发现在不含泊洛沙姆188的制剂 中HMWP的量在时间为零（t=0)时增加。然而在聚山梨醇酯80制剂和不含表面活性剂的制 剂中的HMWP水平降低至与在5°C下储存一个月后分析的含有泊洛沙姆的制剂相当的水平。
[0199] 图2显示在低pH下3 mg/mL泊洛沙姆188优于1. 0 mg/mL聚山梨醇酯80。
[0200] 实施例2 制备缀合物I的制剂实施可制造性研究。
[0201」 液体缀合物I药物物质制刑（包拈组氨酸缓沖刑）以体枳为最终体枳的约40%进 行pH调节至pH 6. 5和7. 1。约60%体积的缓冲剂溶液（组氨酸、甘露糖醇、泊洛沙姆和苯 酚）进行pH调节至pH 6.8。在混合两种溶液后，最终制剂进行pH调节至pH 6.8。自具有 不同pH的制剂制备的pH 6. 8下的制剂跟着在25°C下储存1个月期间进行稳定性研究。
[0202] 分析在时间=0、1天、2周和1个月时取得的样品。
[0203] 所有样品自目视检查显示澄明，并且自SE-HPLC测量的％ HMPW提供在下表中。
[0204] 表1.缀合物I制剂，pH 6. 8的评价 在最终产品制剂的制备期间，没有观察到制剂之间依GH缀合物DS溶液的pH而定的 HMWP水平的明显差异。所有制剂在制备的时候呈现类似水平的HMWP和在其中测试25°C下 储存1个月期间的稳定性的加速稳定性研究中呈现类似的稳定性。对于自具有pH 6. 5的 DS制备的制剂可能观察到一种轻微的趋势，要开发的制剂具有泊洛沙姆188的量越高（1. 0 mg/mL和3. 0 mg/mL)，HMWP随着时间推移的量越高。
[0205] 预计在混合缓冲剂和DS溶液后，由制剂中几乎相当的pH造成所有制剂几乎相似 的稳定性，因为缓冲剂溶液（pH6.8)占最终产品溶液的约60%。
[0206] 实施例3 伴随改变包含甘露糖醇和苯酚的组氨酸缓冲液（0.68 mg/mL组氨酸、44 mg/mL甘露糖 醇和3 mg/mL苯酚）中泊洛沙姆188的浓度（1. 0、3. 0和5. 0 mg/mL)，制备缀合物I的制 剂。通过测量HMWP，测试30°C下，在pH 6. 2、6. 8和7. 4下的稳定性。作为实验（DoE)设计 的研究实施研究。
[0207] 如自图3看到的那样，样品在时间0. (T=0)呈现同等数量的HMWP。在30°C下储 存4周后，HMWP数据的统计分析没有发现泊咯沙姆的显著影响。然而，在pH 6. 2和6. 8两 种情况下观察到一种趋势，要开发的制剂具有泊洛沙姆量增加，HMWP随着时间推移的量越 高，表明如果组合物用于长期储存，那么应避免高浓度的泊洛沙姆188。在图中不包括来自 pH 7. 4的数据，因为导致HMWP形成通常偏低的pH效应占主导。
[0208] 实施例4 在以下实验中研究pH 6. 2、6. 5和6. 8下的效果。伴随改变泊洛沙姆188的浓度（0. 0、 1. 0、3. 0 mg/mL)和伴随改变pH (6. 2、6. 5和6. 8)，制备缀合物I制剂。所测试组合物的其 它组分如在实施例3中那样。样品在室温下伴随剪切物理施压7天。在3和6小时后以及 在1、2、5、6和7天后取样。其它样品经移液施压25次。所有样品进行目视检查，并在340 nm下进一步分析0D (光密度）。
[0209] 如自图4看到的那样，在振动和移液研究两种情况下，与含有1. 0和3. 0 mg/mL泊 洛沙姆188的样品相比较，不含泊洛沙姆188的样品呈现0D 340的明显增大。这种趋势在 所有pH水平下得到证实。图4A呈现全部结果，而图4B仅呈现低的0D 340测量。此外，视 觉评分清楚地显示，不含泊洛沙姆的样品浑浊，并且在降低pH时浊度增大。
[0210] 实施例5 采用3种另外的生长激素化合物，在pH 6. 2和6. 8下实施与实施例4类似的实验。野 生型人生长激素（WThGH)、缀合物I和包括101Cys突变的生长激素变体（GHL101C)，其 也为缀合物I的GH蛋白。如自图5A、5B和5C看到的那样，以上结论得到证实。低的表面 活性剂含量在施加应力初始和之后两种情况下改善组合物的稳定性，如在7天期间测试的 那样。对于缀合物I，不含泊洛沙姆的样品似乎特别依赖于pH。通过视觉评分，观察到随着 pH降低浊度增大。
[0211] 实施例6 微流成像（MFI)评价用于测量生长激素组合物中的颗粒形成。在Micro-FlowImaging流动显微镜MFI5000上测量样品（1mL)。如上，在评价中包括以下化合物：野生型人生长 激素（hGH)、缀合物I、缀合物II和生长激素变体L101C(GHL101C)。
[0212] 在pH 6. 2和pH 6. 8下，用6. 7 mg/mL生长激素化合物评价泊洛沙姆188的稳定 作用。
[0213] 作为应力稳定性研究建立研究，在室温下振动样品多达7天。在pH 6. 2和pH6. 8 下的生长激素组合物包括0. 0、1. 0或3. 0 mg/mL泊洛沙姆188,并在T=0和T=2 (2天）时 进行测量。组合物全部包含〇? 68 mg/mL组氨酸、44. 0 mg/mL和3 mg/mL苯酸。在T=0得到 的数据包括在表1中，而两天后（T=2)得到的数据包含在以下表2中。
[0214] 表1-T=0时的颗粒数量
表2- T=2时的颗粒数量。N/A表示由于太多颗粒而不可能测量颗粒数量。
[0215] 由此得出结论，泊洛沙姆188在所测试的所有生长激素化合物组合物中抑制颗粒 形成。此外，较高浓度（3 mg/mL与1 mg/mL相比较）的泊洛沙姆188对颗粒形成具有较强 的影响。对于GH的缀合物，pH似乎对颗粒抑制具有显著影响，因为在pH 6. 8比在pH 6. 2 下得到更好的结果，减少高泊咯沙姆浓度的优势。通过目视检查得出类似的结论。
[0216] 实施例7 在日本和非亚洲的健康男性受试者实施随机、双盲、安慰剂对照的多剂量和剂量递增 试验，以评价安全性、耐受性和药代动力学（PK)及药效学（PD)参数。
[0217] 16名受试者，4个组，经皮下给药，给予缀合物1 (n=12)或安慰剂（n=4)每周一 次，连续4周（相等数量的日本和非亚洲受试者）。在单独组中剂量为0. 02、0. 08、0. 16和 0.24mg/kg。化合物作为冻干的制剂提供，并在使用前重新组成。
[0218] 在第4个（第4)剂量后评价缀合物I的药代动力学。观察到缀合物1的平均血 浆浓度的剂量依赖性增加（数据未显示）。通过测量IGF-I反应（免疫诊断系统（IDS))评 价缀合物I给予的药效学参数。
[0219] 观察到剂量依赖性的IGF-I和IGFBP-3反应，并且在所有剂量下IGF-I水平升高。 平均IGF-I标准偏差得分（SDS)概况（图6)表明，缀合物I可能适合于每周一次给予。如 果进一步显示，在剂量彡0. 08 mg/kg下诱导临床相关的IGF-I反应。
[0220] 实施例8 药用组合物可通过混合生长激素白蛋白结合体缀合物与需要的赋形剂的制剂进行制 备。当缀合物的液体制剂为起点时，以下方法是有用的。
[0221] 最终组成： 生长激素缀合物I (6. 7 mg/ml) 1. 0 mg/ml泊略沙姆188 0? 68 mg/ml组氨酸 44 mg/ml甘露糖醇 4. 0 mg/ml 苯酸 制剂的pH为6. 8 储备溶液： 21.3和20.5 11^/1111生长激素缀合物1(在0.68 11^/1111组氨酸中）（批次10(040501 和 NLfK040503) 2〇 mg/ml泊咯沙姆1洲（在WFI中） 缓冲剂溶液：11〇 mg/ml甘露糖醇、10 mg/ml苯酸和组氨酸，其中组氨酸浓度取决于所 使用的DS的体积/数量。
[0222] 用于pH调节的HC1 称出缀合物I制剂（包括组氨酸缓冲剂），并加入泊咯沙姆188,作为储备液。向溶液 中加入WFI，以达到最终体积的55%。制备包括甘露糖醇、组氨酸、苯酚和用于pH调节的盐 酸的缓冲剂溶液。把缓冲剂溶液（最终体积的40%)加入到缀合物I和泊咯沙姆188溶液 中，导致最终体积的95%。测量pH (并且如果必要进行调节），并最后加入WFI，以达到最终 体积。
[0223] 在制备期间，自缀合物I和泊咯沙姆188溶液和自中间制剂和最终药用组合物取 样。经SE-HPLC测量高分子量蛋白的含量（％ HMWP)(表1)，并发现在整个过程偏低。最终 药用组合物显示澄明和无色。
[0224] 表1-缀合物1制剂、加工过程中的样品和最终制剂的HMWP(%) 实施例9 在另一项研究中，在苯酚-缓冲剂溶液中以不同浓度（5、10和30 mg/ml)包括苯酚，并 引入到缀合物I制剂中。如以下看到的那样，使用30 mg/ml苯酚在最终制剂中给出％ HMWP 的增加。HMWP的水平取决于溶液中缀合物I的浓度和苯酚的浓度。
[0225] 储备溶液和赋形剂： 缀合物 I 制剂（批次 IHJel2-021) :18. 0 mg/ml 苯酸溶液 30 mg/ml、10 mg/ml 和 5 mg/ml 50 mg/ml泊略沙姆 甘露糖醇（粉末） 组氨酸 对于每一种制剂，制备在最终制剂中包括达到期望的浓度的苯酚和组氨酸总量的苯酚 和组氨酸溶液。
[0226] 以最终制剂中达到总量的量，把缀合物I制剂加入到苯酚-组氨酸溶液中，取加 工过程中的样品，并随后以在最终制剂中达到期望的浓度的量加入泊咯沙姆188和甘露糖 醇。先前的研究（未显示）已经揭示了如果在缓冲剂溶液中包括泊咯沙姆188和甘露糖醇 则存在溶解性问题。最后加入WFI，以达到最终体积，用盐酸调节pH。
[0227] 最终制剂： 2. 0、3. 3、6. 7和10 mg/ml生长激素缀合物I 1. 0 mg/ml泊略沙姆188 0? 68 mg/ml组氨酸 44 mg/ml甘露糖醇 3. 0 mg/ml 苯酸 pH 6. 3〇
[0228」 表2 M亦加丄过桎中的样品和最终制刑中侬起始苯酚浓度和GH浓度向足的HMWP (%)。缀合物I制剂的初始HMWP水平为3. 7%。当高浓度苯酚与低浓度生长激素缀合物混合 时，得到很高的HMWP含量。
【主权项】
1. 一种药用组合物，所述组合物包含2-20 mg/mL的生长激素白蛋白结合体缀合物 (GH-AB)、缓冲剂、防腐剂和0? 5-5. 0 mg/mL的表面活性剂。2. 权利要求1的组合物，其中所述组合物包含I mg/mL的泊洛沙姆188作为表面活性 剂。3. 前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物包含组氨酸缓冲剂。4. 前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物不包含甘氨酸。5. 前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物的pH为6. 5-7. 0,优选地为6. 8。6. 前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物包含2. 0-4. 0 mg/mL的苯酚或 3. 0-4. 0 mg/mL 苯酸。7. 前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物包含等渗剂，比如40-45 mg/mL 甘露糖醇。8. 前述权利要求中任一项的组合物，其中AB-经GH中的cys残基连接于GH。9. 前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物用于生长激素缺乏症（GHD)或成 人生长激素缺乏症（AGHD)的治疗方法。10. 前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物用于经每周一次给予的治疗方 法。11. 前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物用于经每周一次给予 0.01-0. 08 mg/kg的剂量，来治疗生长激素缺乏症（GHD)或成人生长激素缺乏症（AGHD)。12. -种用于治疗生长激素缺乏症（GHD)或成人生长激素缺乏症（AGHD)的方法，所述 方法包括给予有需要的患者治疗有效量的权利要求1-9中任一项的药用组合物。13. 权利要求12的方法，其中所述组合物每周一次给予。14. 权利要求12的方法，其中所述组合物每周一次给予患有生长激素缺乏症的成人患 者。15. 权利要求12或13的方法，其中所述组合物给予患有生长激素缺乏症的患者，其中 每剂量给予〇. 01-0. 08 mg/kg的所述生长激素白蛋白结合体缀合物。
【专利摘要】本发明涉及生长激素化合物的组合物，包括药用制剂。所述组合物能够提供生长激素化合物的初始和长期稳定性，致使这种组合物适合用作药用制剂。
【IPC分类】A61K47/18, A61K47/10, A61K47/26, A61K38/27, A61K47/48
【公开号】CN105120887
【申请号】CN201480019663
【发明人】J.尼尔森, M.埃斯克林, S.G.克里斯滕森, M.霍比, M.B.奥尔森
【申请人】诺和诺德保健股份有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2014年4月4日
【公告号】WO2014166836A1, WO2014166836A8