Csf1治疗剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及物质组合物以及在增强受损肝脏再生或恢复其功能中使用该物质组 合物的方法。该物质组合物适用于治疗肝病，例如用于预防和/或治疗急性或慢性肝脏疾 病或用作支持疗法以改善在肝脏切除或肝脏移植之后的结果。
【背景技术】
[0002] 肝脏疾病是世界范围内致病率和死亡率的主要原因，但尽管如此，目前不存在增 强患病或受损肝脏的再生的有效疗法。增强肝脏再生的疗法可以在一系列医学和手术情 形内应用于包括急性、慢加急或慢性肝脏衰竭的适应症中。在医学环境中，急性肝脏衰竭 可能起因于一系列病因，但最常归因于感染（病毒性肝炎）、酒精摄取或毒素用药过量（如 Paracetamol?用药过量）。在急性肝脏衰竭中，可能发生分布广泛的肝脏组织坏死，这可 以快速导致死亡。急性肝脏衰竭可能起因于慢性肝脏疾病背景（慢加急），其中预先存在的 肝脏疾病（归因于病毒性肝炎、酒精、非酒精性脂肪肝病以及其他原因）进一步削弱肝脏的 再生能力。慢性肝脏衰竭可能起因于肝脏功能的逐步恶化（原因如上）直到肝脏不能维持 内稳态为止。在威胁生命的肝脏衰竭中，唯一的选择是肝脏移植，然而在潜在供体与接受者 之间的差额意味着许多患者将在等待肝脏移植的过程中死亡。
[0003] 肝脏再生是涉及许多生长因子、细胞因子以及细胞类型的复杂过程。肝脏巨噬细 胞起到一系列至关重要的内稳态作用，并且对有效肝脏再生是关键的。巨噬细胞集落刺激 因子（M-CSF)也称为集落刺激因子I(CSFl)可互换使用，其表达于肝脏中并且是负责产生 和维持单核细胞/巨噬细胞谱系细胞（包括肝脏巨噬细胞）的主要因子。巨噬细胞的耗尽 和CSFl的缺乏在部分肝切除之后导致肝脏再生被削弱。从现有技术中已知，在M-CSF缺失 小鼠模型中，在部分肝切除之后，M-CSF诱生的库普弗细胞（Kupffer cell)在肝脏再生中 起关键作用（雨宫（Amemiya)等人，《外科研究杂志》（J. Surg. Res.) 165, 59-67, 2011)。然 而，CSFl补充以增强肝脏再生的潜能迄今未得到考虑。
[0004] 增强肝脏再生和/或恢复其功能的疗法可以在一系列医学和手术情形内应用于 包括急性、慢加急或慢性肝脏衰竭的适应症中，并且将立即向患者、临床医师以及类似的健 康服务提供益处。
[0005] 增强肝脏再生的疗法可以按急救疗法的形式应用以在移植之后或在压倒性衰竭 情形下促进再生、或用于预防慢性肝脏疾病中的衰退，该疗法将立即向患者、临床医师以及 类似的健康服务提供益处。
【发明内容】
[0006] 根据本发明的第一方面，提供一种CSFl蛋白生物活性片段或其同系物或变体或 衍生物，用于增强肝脏再生和/或恢复肝脏功能和/或调节肝脏内稳态。
[0007] 也包括编码该CSFl蛋白生物活性片段或其同系物或变体或衍生物的核酸。
[0008] 诸位发明人已经出乎意料地发现，向具有正常CSF-I水平的受试者给予另外或额 外或补充的CSF-I增加健康动物中肝脏的大小并且提升在由不同原因造成的功能损失之 后修复肝脏的能力。意外的发现是，向个体中已经起作用的CSF-I补充CSF-I将改善肝再 生或功能。肝脏处于极严格的内稳态下，并且迄今为止尚未认识到可以在临床环境中成功 地调节肝内稳态并且将肝脏大小增加到高于相对于总体重的正常值的药剂。然而，本发明 提供在哺乳动物物种中使用CSF-I作为适当的肝营养和内稳态剂的证据。此外，本发明是 基于CSF-I可以恢复肝脏吞噬能力的观察结果，并且因此使用CSF-I蛋白来恢复肝脏功能 的这个方面在本发明中尤其受关注。
[0009] 根据本发明的另一个方面，提供一种融合蛋白，该融合蛋白包含：
[0010] (i) CSF-I生物活性片段或其同系物或变体或衍生物；和 [0011] (ii)生物活性抗体片段。
[0012] 优选地，出于人类疗法的目的，CSF-I的生物活性片段是人类CSF-I的残基 33-182 (SEQ ID NO: 5)或其生物活性部分、或来自任何哺乳动物物种的CSF-I生物学等效片 段。
[0013] CSF-I的生物活性片段可以是天然的，或它可以是重组的。
[0014] 优选地，抗体是选自下组的免疫球蛋白，该组包括IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，更 优选地，该抗体是IgG。
[0015] 优选地，抗体片段选自下组，该组包括F(ab'）2、Fab'、Fab、Fv、Fc以及rlgG，并且 更优选地，该抗体片段是FC片段。
[0016] 优选地，融合蛋白的CSF-I生物活性片段或其同系物或变体或衍生物与生物活性 抗体片段直接或经由连接子部分共价连接。
[0017] 根据本发明的另一个方面，提供一种编码该融合蛋白的核酸。
[0018] 根据本发明的又另一个方面，提供一种包含本发明的经分离核酸的载体。
[0019] 根据本发明的又另一个方面，提供一种包含本发明载体的宿主细胞。
[0020] 根据本发明的又另一个方面，提供一种制造本发明第一方面的融合蛋白的方法， 该方法包括：
[0021] (i)培养本发明的宿主细胞；并且
[0022] (ii)从所述培养物中收集该融合蛋白。
[0023] 根据本发明的又另一个方面，提供一种组合物，该组合物包含：
[0024] (a)至少一种融合蛋白，该融合蛋白包含（i)CSF-l生物活性片段或其同系物或变 体或衍生物；和（ii)生物活性抗体片段；和
[0025] (b)药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
[0026] 在替代性实施例中，该组合物可以包含本发明的核酸或载体。
[0027] 根据本发明的另一方面，提供一种融合蛋白的用途，该融合蛋白包含：
[0028] (i)CSF-I生物活性片段或其同系物或变体或衍生物；和
[0029] (ii)生物活性抗体片段
[0030] 用于增强肝脏再生和/或恢复肝脏功能和/或调节肝脏内稳态。
[0031] 在手术环境中，手术去除肝脏中含有肝癌的区域是治愈性管理的主体。这可能产 生手术后肝脏衰竭的风险，尤其在患者具有慢性肝脏疾病背景的情况下。在肝脏移植的情 形下，如果所移植的器官不足以满足接受者的需求，那么肝脏衰竭可能继续。用增强再生的 疗法来治疗可以在手术之前、期间或之后来进行应用。
[0032] 根据本发明的另一个方面，提供本发明的融合蛋白或核酸或载体的用途，用于制 造用于增强肝脏再生和/或恢复肝脏功能和/或调节肝脏内稳态的药剂。
[0033] 根据本发明的又另一个方面，提供一种治疗患有肝癌并且将进行手术的个体的方 法，该方法包括在手术程序之前、期间或之后给予本发明的融合蛋白或核酸或载体。
[0034] 根据本发明的又另一个方面，提供一种治疗正进行肝脏移植手术的个体的方法， 该方法包括在手术程序之前、期间或之后给予本发明的融合蛋白或核酸或载体。
[0035] 根据本发明的又另一个方面，提供一种试剂盒，该试剂盒包括一个或多个具有药 物剂量单元的容器，这些药物剂量单元包含有效量的本发明的融合蛋白或核酸或载体，其 中该容器包装有任选的用于使用它的说明书。
[0036] 本发明的不同方面提供在人类和其他哺乳动物物种中增强受损肝脏再生或恢复 其功能的组合物和方法
[0037] 归于本发明任何方面的特征在加以必要修正的情况下可适用于本发明的所有其 他方面。
【附图说明】
[0038] 借助于非限制性实例、参考附图进一步在下文中描述本发明的实施例，在这些附 图中：
[0039] 图1显示三个损伤模型中的卡普兰-梅尔存活率（Kaplein Meir of survival)， 并且图表显示在干预和处理之后的重量变化百分比。***p〈〇. 001曼-惠特尼U(Mann Whitney U)。[实线=使用fc-CSFl处理；虚线=PBS对照]
[0040] 图2是展示肝脏重量/体重比率（表示为百分比）和肝细胞增殖（表示为每个高 倍视野中的Ki67阳性肝细胞）的条形图。*ρ〈(λ 05 ;#ρ〈(λ 01 001曼-惠特尼U。
[处理=fc-CSFl ;对照=PBS]
[0041] 图3显示如上文所描述给予的CSF-I对体重的作用。图3A比较CSF-I (lmg/kg)与 Fc-CSF-I (lmg/kg)。未经修饰的蛋白质在这个剂量下没有作用，而Fc-CSF-I明显增加总体 重。图3B显示剂量响应曲线，表明在0. lmg/kg Fc-CSF-I下的可检测活性。图3C显示，在 更大实验系列中证实lmg/kg剂量的作用。在后续幻灯片中进一步分析这个系列中的动物。
[0042] 图4A显示CSF-I (lmg/kg)和Fc-CSF-I (lmg/kg)对小鼠脾脏重量的作用，图4B显 示CSF-I (lmg/kg)和Fc-CSF-I (lmg/kg)对小鼠肝脏重量的作用。
[0043] 图5显示Fc-CSF-I对脾脏中巨噬细胞数目（使用csf Ir-EGFP报告基因来检测） 的作用，图5A是对照并且图5B显示经处理的样本。
[0044] 图6A显示对图5A和5B的剂量响应曲线，图6A显示基于巨噬细胞特异性F4/80 抗原的免疫组织化学定位的剂量响应曲线。
[0045] 图7显示对小鼠中巨噬细胞特异性F4/80抗原的免疫染色。图7A显示经PBS处 理的对照肝脏；图7B显示用Fc-CSF-I处理的小鼠的肝脏，图7C显示经PBS处理的对照脾 脏，图7D显示用Fc-CSF-I处理的小鼠的脾脏。
[0046] 图8A显示具有针对增殖细胞核抗原（PCNA)免疫染色的经PBS处理的对照小鼠肝 脏，图8B显示在用Fc-CSF-I处理之后的小鼠肝脏。
[0047] 图9显示向断奶仔猪给予的CSF-I的药物动力学影响。图9A显示未经修饰的 CSF-I的清除率，图9B和9C显示在分别静脉内和皮下给予时I. 2mg/kg的Fc-CSF-I的清除 率。
[0048] 图10显示在给予0. 5mg/KgX6的断奶仔猪中的血液作用；图IOA显示总白细胞计 数，图IOB显示单核细胞计数，图IOC显示淋巴细胞计数，并且图IOD显示中性粒细胞计数。
[0049] 图11显示在给予0. 5mg/KgX6的断奶仔猪中血液作用的剂量响应曲线；图IlA显 示总白细胞计数，图IlB显示单核细胞计数，图IlC显示淋巴细胞计数，并且图IlD显示中 性粒细胞计数。
[0050] 图12显示对给予0. 12mg/KgX3的断奶仔猪中的器官重量的作用。图12A显示对 肝脏重量的作用，图12B显示对脾脏重量的作用，图IlC显示对肺重量的作用，并且图IlD 显示对肾脏重量的作用。
[0051] 图13A显示在患有扑热息痛诱发的肝脏衰竭的存活或死亡/进行肝脏移植的患者 中，在入院时的患者血清CSFl水平。图13B显示随后死亡或存活的患者子集的血清水平。 图13C显示接受者操作特征曲线分析，该分析评估入院时CSFl充当在扑热息痛用药过量之 后不进行移植的情况下的存活率的生物标记的潜能。
[0052] 图14A显示在扑热息痛中毒之后的肝CSFl基因表达和血清CSFl水平。图14B显 示通过Ki67免疫组织化学在扑热息痛中毒之后第3天评估的肝脏与体重比率和肝细胞增 殖。图14C显示在扑热息痛中毒后第3天时比较对照和CSFl受体抑制的血清分析。
[0053] 图15A显示在扑热息痛中毒之后比较CSFl-Fc(实线）或对照（点线）给药的小 鼠中平均肝脏重量与体重比率和肝细胞增殖（ki67免疫组织化学）。图15B显示扑热息痛 中毒后的血清参数。（η = 8个/组）。
[0054] 图16Α显示在2/3部分肝切除之后的肝CSFl基因表达和血清CSFl水平。图16Β 显示通过Ki67免疫组织化学在2/3部分肝切除之后第2天评估的使用CSFl受体抑制 (GW2580)或对照的肝脏与体重比率和肝细胞增殖。图16C显示在扑热息痛中毒后第2天比 较对照和使用GW2580的CSFl受体抑制的血清分析。（η =每组8个）。
[0055] 图17Α显示在2/3部分肝切除之后比较CSFl-Fc (实线）或对照（点线）给药的 小鼠中平均肝脏重量与体重比率和肝细胞增殖（ki67免疫组织化学）。图17Β显示扑热息 痛中毒后的血清参数。（η = 8个/组）。图17C显示再生前细胞因子116和抑瘤素 M(OSM) 以及生长因子活化子尿激酶受体（UR)在阻断CSFl受体（GW2580)和给予CSFl-Fc的情况 下对比对