包含富集主要电荷同工型的抗体组合物的新药物的制作方法

包含富集主要电荷同工型的抗体组合物的新药物的制作方法
【专利说明】包含富集主要电荷同工型的抗体组合物的新药物 发明领域
[0001] 本发明属于设及借助ADCC摧毁祀细胞的机制的抗体疗法技术领域。它设及作 为药物使用的纯化抗体组合物，所述的纯化抗体组合物通过W下获得：借助层析对抗体组 合物中天然存在的不同电荷同工型分离并且合并与层析图主峰相对应的一个或多个层析 级分，因而获得富含所述主峰的单克隆抗体组合物，后者占获得的组合物的层析图的至少 85%。 现有技术
[0002] 在过去十年期间，已经在W下各种治疗领域借助抗体、经常借助单克隆抗体大力 开发被动免疫疗法治疗：癌症、化esus阴性怀孕女性中预防同种异体免疫、感染性疾病、炎 性疾病W及尤其自身免疫疾病。
[0003] 尽管借助抗体的被动免疫疗法治疗如今已经显示其治疗益处，但是观察到的临床 反应水平仍然不足，并且因此需要有可能增加临床反应并施用更小剂量的更高效抗体组合 物，W便限制副作用。
[0004] 如同任何生物产品，抗体组合物本质上是不均一的。实际上，治疗中所用的抗体组 合物在生物系统（细胞、转基因动物或植物）中产生，其中蛋白质通常并且因此尤其抗体经 受众多翻译后修饰（酶促修饰或降解），运将在一种抗体分子与另一种抗体分子见不同并 因而在产生的抗体组合物内部生成微小异质性。
[0005] 抗体是由四条多肤链组成的糖蛋白可变数目二硫键和非共价相互作用结合的 两条总体上相同的重链（所谓"H"链即"重"链）和两个总体上相同的轻链（所谓"L"链 即"轻"链）。运些链形成Y型结构，重链构成Y型结构的茎部并构成Y型结构的每条臂的 一半，轻链构成Y型结构的每条臂的一半。每条轻链由一个恒定结构域（CJ和一个可变结 构域（\)组成；重链由一个可变片段（Vh)和3个或4个恒定片段（Chi至CH3或CH4)组成， 运取决于抗体同种型（IgG包含3个恒定片段Chi至CJ。轻链（\+Cj和重链Vh结构域和 Chi结构域的结合形成Fab片段，结合的结构域VL和VH负责识别抗原。两条重链的恒定结 构域（Ch2和CH3)或（Ch2至CH4)形成恒定化片段。
[0006] 已知抗体经历W下翻译后修饰：重链或轻链末端修饰，Fc部分（和任选地F油）糖 基化、脱酷胺化、异构化、氧化、片段化和聚集（参见Vlasak等人，-2008)。
[0007] 大多数翻译后修饰导致抗体的表面电荷特性改变，或通过修饰带电荷基团的数目 直接改变，或通过引入结构性修饰间接地改变，所述的结构性修饰本身调整带电荷残基的 局部分布或改变它们的地a。因此，全部运些修饰也均生成微小异质性，许多同工型具有同 一种抗体的不同电荷，具有不同的等电点（pl)，因此共存于抗体组合物内部（参见Vlasak 等人，- 2008)。
[0008] 在翻译后修饰当中，抗体恒定部分Fc的糖基化如今因强烈影响抗体的许多生物 学特性而知名：体内半寿期（参见Wri曲t等人，-1994)，诱导ADCC反应（抗体依赖性细 胞毒性细胞反应）的能力（参见Satoh等人，- 2006，Presta等人，- 2006)、CDC反应（补 体依赖性细胞毒反应，参见Wri曲t等人，- 1994，Presta等人，- 2006)等。特别地，岩藻 糖化聚糖形式的抗体组合物的含量如今已知非常强烈地影响组合物在体内诱导ADCC反应 的能力。
[0009] 相反，虽然许多文章旨在表征抗体组合物中存在的电荷同工型W判定商业批次单 克隆抗体的再现性和质量，但是直到现在仍认为导致同一种抗体的许多不同电荷同工型在 抗体组合物内部存在的其他翻译后修饰对抗体的体内生物学特性影响甚微或无影响。因 此，虽然现有技术中通常认为就电荷同工型方面追踪商业批次抗体的质量是必不可少的， 但是将运种追踪视为纯粹追踪产品质量并且从未存在建议为治疗目的，使用抗体组合物的 极度富含特定电荷同工型的纯化级分。实际上，在没有显示明显影响抗体组合物的至少某 些生物学特性的情况下，没有理由不使用整个组合物，没有理由使得制备方法复杂化和降 低产率。现在，如上文所示，除了糖基化W外，直至现在仍认为导致抗体的许多不同电荷同 工型在抗体组合物内存在的其他翻译后修饰不改变抗体的生物学特性。
[0010] 导致几种电荷同工型出现的修饰之一是酶促裂解抗体重链中的C末端赖氨酸。一 旦抗体在表达簇肤酶的细胞中产生，则取决于抗体分子，运种裂解在不同水平发生。C末端 赖氨酸的存在产生相当碱性的性质，原因在于赖氨酸的侧链。其一条重链或两条重链上的 赖氨酸裂解因此产生酸性更强的同工型。通常，存在重链上具有0、1或2个C末端赖氨酸 的同工型，因此产生具有略微不同pi的S种同工型（参见Vlasak等人，- 2008)。关于运 种特定修饰，Antes等人，-2007描述了通过等电聚焦（IE巧分析在血清存在或不存在情 况下产生的在癌症被动免疫疗法中使用的批量人源化单克隆抗Lewis-YIGN311抗体。作 者显示在血清存在或不存在情况下产生的抗体组合物的电荷同工型概况是不同的，在血清 不存在下产生的组合物比血清存在下酶促切割抗体重链的C末端赖氨酸产生的组合物受 影响更小。分析运种修饰对两种组合物诱导CDC反应的相应能力（借助补体）尚未显示与 运种修饰相关的任何明显效应。
[0011] 导致几种电荷同工型在抗体组合物内部出现的另一类型修饰是N末端谷氨酷胺 或谷氨酸残基环化，运导致焦谷氨酸盐（P巧基团的形成并且因此导致酸性更强的同工型。 运种修饰在完整抗体组合物中W不同水平系统出现，但不认为它能够影响抗体的功能特性 (参见Vlasak等人，- 2008)。
[0012] 导致几种电荷同工型在抗体组合物内部出现的再一类型修饰是形成共价加合物 和明显糖化现象（非酶促地添加糖），尤其在赖氨酸残基上，运产生酸性更强的同工型。也 不认为运种类型的修饰能够影响抗体的功能特性（参见Vlasak等人，-2008)。
[0013] 导致几种电荷同工型在抗体组合物内部出现的另一个寻常类型修饰是天冬酷胺 残基的脱酷胺化和天冬氨酸残基的异构化，运产生酸性更强的同工型。在抗体的恒定部分 中，对脱酷胺化现象敏感的天冬酷胺残基位于C册结构域，远离Fc化受体和Fc丫R受体结 合位点。因此通常不认为运些修饰能够影响抗体的功能特性（参见Vlasak等人，- 2008)。 化awli等人，-2010和Gamlhi等人，-2011描述了使用阳离子交换树脂W层析技术分离 被动免疫疗法中所用单克隆抗体组合物的主要同工型、酸性同工型和碱性同工型；对导致 几种同工型存在的翻译后修饰的分析；W及研究=种纯化级分（酸性级分、主要级分和碱 性级分）的药代动力学特性和某些功能特性的研究。在两种情况下，天然组合物的层析图 总是显示一个由包含酸性同工型的峰和包含碱性同工型的峰包围的主峰。鉴定的翻译后修 饰尤其包括某些二硫键还原化hawli等人，-2010)、糖化化hawli等人，-2010 ;GarKlhi等 人，-2011)、脱酷胺化（Khawli等人，-2010 ;GarKlhi等人，-2011)、切割重链C末端赖氨 酸（Khawli等人，-2010;GarKlhi等人，-2011)、存在聚集物（Gamlhi等人，-2011)、氧化 现象（Gan化i等人，-2011)。药代动力学特性的分析（Fc化结合及体内检验，引自化awli 等人，-2010)没有作出=种所测试纯化级分在行为方面存在显著差异的任何展示。在运 两篇文章中，还在效应细胞不存在的情况下测试了=种纯化级分抑制细胞系体外增殖的能 力，其中所述细胞系表达抗体对其有特异性的抗原。运种检验有可能展示与抗原结合的能 力和诱导调亡的能力。虽然运两篇文章中酸性级分具有极轻微较低的能力，但是结果不明 显并且因此没有在=种纯化级分之间观察到显著差异。另外在分离=种级分之前，与总抗 体组合物相比，富含主要同工型的级分不具有增强的能力。
[0014] 另外，其他文献描述了如何分析和/或分离抗体的某些电荷同工型，但是没有比 较不同同工型的效应子特性。因此，EP1308456和W0 2004/024866描述了旨在移除单克隆 抗体组合物酸性变体的层析方法，在纯化之前和之后尚未测试该组合物的效应子特性。而 且，W02011/009623描述了旨在抑制单克隆抗体组合物酸性变体或碱性变体的层析方法，在 纯化之前和之后尚未测试该组合物的效应子特性。另外，运份文献中描述的方法仅允许抑 制单一类型的变体并且仅酸性变体的移除实际上适用。
[0015] 因此，除了已知对抗体的功能特性有影响的糖基化外，现有技术中可获得的设及 (从引起主要同工型的不同修饰）产生几种电荷同工型的其他翻译后修饰的要素，表明运 些修饰对抗体的功能特性没有任何影响。
[0016] 但是，发明人已经令人惊讶地发现通过层析纯化的富含抗体组合物主要电荷同工 型的级分具有借助CD16受体通过表达运种受体的效应细胞诱导效应子反应的显著更强能 力。因此，富含抗体组合物主要电荷同工型的纯化级分有可能在体内诱导更强ADCC反应和 更强CDC反应，并因此有可能增加临床反应和/或减少施用的剂量，因而限制副作用。
[0017] 发明简述
[0018] 本发明因此设及一种可W通过W下方法获得的单克隆抗体组合物，所述方法包 括：
[0019]a)从细胞克隆、从非人类转基因动物或从转基因植物产生单克隆抗体组合物，
[0020] b)通过层析将步骤（a)中获得的组合物分级分离，并且
[0021]C)合并步骤b)中获得的与层析图主峰相对应的一个或几个层析级分，因而获 得的单克隆抗体组合物富含所述主峰，后者占步骤C)中获得的组合物的层析图的至少 85%、有利地至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、更有利地至少90%、至少91%、 至少92%、至少93%、至少94%、或甚至至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 98. 5%、至少99%或至少99. 5%，
[0022] 其作为药物使用。
[0023] 有利地，通过标准离子交换层析、通过层析聚焦或通过疏水相互作用层析将步骤 (a)中获得的组合物分级分离，实现步骤b)。
[0024] 有利地，离子交换层析使用W下洗脱手段之一：
[00幼 ?离子力梯度讯/或
[0026]?抑梯度；或
[0027] ?置换分子。
[0028] 有利地，在用作药物的运种组合物中，至少95%、有利地至少96%、至少97%、至 少98%、或甚至至少98. 5%、至少99%、或至少99. 5%在组合物中存在的抗体的重链不包 含任何C末端赖氨酸残基。
[0029] 本发明还设及一种单克隆抗体组合物，其中至少9 5 %、有利地至少9 6 %、至少 97 %、至少98 %、或甚至至少98, 5 %、至少99 %、或至少99. 5 %在组合物中存在的抗体的重 链不包含任何C末端赖氨酸残基，其作为药物使用。
[0030] 在作为本发明药物使用的组合物中，该抗体有利地针对健康供体细胞上存在的非 遍在抗原、癌细胞抗原或病原体感染的细胞的抗原。
[0031] 特别地，优选W下实施方案：
[0032] -该抗体是抗化esusD抗体并且组合物意在预防化esus阴性个体中的同种异体 免疫。
[0033] -该抗体针对癌细胞的抗原并且组合物意在治疗癌症，
[0034] -该抗体针对病原体感染的细胞的抗原并且组合物意在治疗由所述致病生物所致 的感染，
[0035] -该抗体针对免疫细胞的抗原并且组合物意在治疗自身免疫疾病。
[0036] 在一个有利的实施方案中，在作为本发明药物使用的组合物中，抗体包含增加其 与Fc丫RIII受体结合和其借助Fc丫RIII受体的效应子特性的Fc片段的修饰。作为本发 明药物使用的组合物尤其可W在Fc片段中包含增加其与Fc丫RIII受体结合和/或降低岩 藻糖含量的突变。特别有利地，组合物中存在的抗体在其Fc片段的N-糖基化位点上具有 双天线型聚糖结构，岩藻糖含量小于65%。
[0037] 在一个有利的实施方案中，在作为本发明药物使用的组合物中，抗体包含增加其 与蛋白质Clq结合和其借助补体的效应子特性的Fc片段修饰。
[0038] 本发明还设及层析分级分离步骤的用途，用于增加针对给定抗体的单克隆抗体组 合物通过表达Fc丫RIII受体（CD16)的免疫系统效应细胞诱导表达所述抗原的祀细胞的抗 体依赖性细胞毒性（ADCC)的能力。
[0039] 本发明还设及层析分级分离步骤的用途，用于增加针对给定抗体的单克隆抗体组 合物通过补体诱导表达所述抗原的祀细胞的补体依赖性细胞毒性（CDC)的能力。
[0040] 附图简述
[0041] 图1.通过层析聚焦抗CD20抗体组合物的=种分离物获得的层析图（阴离子交换 树脂（GELifeSciences销售的柱Mono?)，通过递降抑梯度（通过使用两种缓冲液：缓冲 液A(二乙醇胺 25mM)，缓冲液B(polybuffer96+pha;rmalyte8-10. 5)从 9. 5 至 8. 0)洗 脱。将抗体组合物脱盐，并注射20mg到柱上。收集2mL级分。收集级分33至50用于分析。
[0042] 图2.与借助阳离子交换层析的11份分离物相对应的11份层析图的叠加（与A 相同的柱和洗脱）。将级分F1至F20收集并根据各峰分组：P1 (酸性，F1至F3)、P2 (酸性， F4和巧）、P3(酸性，F6)、P4(主要峰，巧至F10)、P5(碱性，F11)、P6(碱性，F12至F14)、 P7 (碱性，F15 至F17)和P8 (碱性，F18 至F20)。
[0043] 图3.通过CEX产生的抗CD20抗体组合物的层析图。A.纯化之前抗CD20抗体组 合物的层析图。B.分离（A)之前与层析图主峰相对应的装配级分1至20形成的组合物的 层析图。显示了各种峰的百分数。
[0044] 图4.通过阳离子交换层析纯化的级分与CD16的结合度iacore)。每份样品与 CD16的结合表述为参比样品与CD16结合的百分数。
[0045] 图5.通过层析聚焦（A)或通过阳离子交换层析度）纯化的级分的CD16活性。每 份样品的CD16活性仰16化rkat细胞分泌IL- 2)表述为参比样品的CD16活性的百分数。
[0046] 图6.通过阳离子交换层析纯化的级分的补体依赖性细胞毒性（CDC)。每份样品的 CDC反应表述为参比样品的CDC反应的百分数。
[0047] 发明详述
[0048] 本发明因此设及一种可W通过W下方法获得的单克隆抗体组合物，所述方法包 括：
[0049] a)从细胞克隆、从非人类转基因动物或从转基因植物产生单克隆抗体组合物，
[0050] b)通过层析将步骤（a)中获得的组合物分级分离，并且
[0051] C)合并步骤b)中获得的与层析图主峰相对应的一个或几个层析级分，因而获 得的单克隆抗体组合物富含所述主峰，后者占步骤C)中获得的组合物的层析图的至少 85%、有利地至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、更有利地至少90%、至少91%、 至少92%、至少93%、至少94%、或甚至至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 98. 5%、至少99%或至少99. 5%，
[0052] 其作为药物使用。
[0053] 在步骤（a)中），从细胞克隆、从转基因动物或从转基因植物产生单克隆抗体组合 物。
[0054] "抗体"或"免疫球蛋白"意指一种分子，所述分子包含至少一个与给定抗原结合的 结构域和包含能够与FcR受体结合的Fc片段的恒定结构域。在大部分哺乳动物如人和小 鼠中，抗体由4条多肤链组成：2条重链和2条轻链，所述链由可变数目的确保分子灵活性 的二硫键连接在一起。每条轻链由一个恒定结构域（CL)和一个可变结构域（VL)组成；根 据抗体同种型，重链由一个可变结构域（VH)和3个或4个恒定结构域（CH1至C册或CH1 至CH4)组成。在一些罕见哺乳动物如骆驼和羊驼中，抗体仅由两条重链组成，每条重链包 含一个可变结构域（VH)和一个恒定区。
[0055] 可变结构域参与抗原识别，而恒定结构域参与抗体的生物学、药代动力学和效应 子特性。
[0056] 不同于可变结构域（其序列从一种抗体至另一个抗体之间剧烈变动），恒定结构 域W-种抗体至另一个抗体之间（典型地物种的和同种型的）非常接近的氨基酸序列为 特征，同时任选地具有一些体细胞突变。Fc片段天然地由重链恒定区组成，不包括结构域 CH1，即由下边界区域和恒定结构域C肥和C册或C肥至CH4组成（取决于同种型）。在人 IgGl中，完整Fc片段由始于位置226内半脫氨酸残基（C226)的重链C末端部分组成，在本 说明书全文中Fc片段中氨基酸残基的编号是Edelman等人，- 1969和K油at等人，-1991 中描述的index化编号。其他类型免疫球蛋白的相应Fc片段可W由本领域技术人员通过 序列的比对轻易鉴定。
[0057] Fc片段在C肥结构域中被糖基化，在2条重链的每一条上存在与第297位置内天 冬酷胺残基（Asn297)结合的N-