30 ;至少1. 35 ;至少1. 40 ;至少 1. 45;或甚至至少1. 50 (对应于ADCC水平增加至少50% )。
[0186] 本发明还设及层析分级分离步骤的用途，用于通过补体，增加针对给定抗体的单 克隆抗体组合物诱导表达所述抗原的祀细胞的补体依赖性细胞毒性（CDC)的能力。
[0187] 因而获得的组合物具有改善的通过补体诱导对表达目的抗原的祀细胞的溶解的 能力。优选地，用富含主峰同工型的组合物获得和用分级分离前组合物获得的CDC水平的 比例R(由W下式限定）：
[0188] 是至少1. 15 (对应于CDC水平增加至少15% );有利地至少1. 16;至少1. 17;至 少1. 18 ;至少1. 19 ;更有利地至少1. 20 ;至少1. 25 ;至少1. 30 ;至少1. 35 ;至少1. 40 ;至少 1. 45 ;或甚至至少1. 50 (对应于CDC水平增加至少50% )。
[0189] 在W上两种用途中，层析分级分离步骤可W按上述的任何方式实施W获得作为本 发明药物使用的富含主要同工型的抗体组合物。特别地，可W通过W下层析技术之一实施 分级分离：
[0190] ?离子交换层析，无论洗脱模式是什么（离子力梯度、抑梯度、抑和离子力梯度、 置换分子）；
[0191] ?层析聚焦；
[0192] ?疏水相互作用层析。
[0193] 单克隆抗体组合物可W是上文描述的任何单克隆抗体组合物，对所述单克隆抗体 组合物实施运种层析分级分离步骤W借助表达CD16的效应细胞增加ADCC或CDC反应能 力。特别地，组合物中存在的单克隆抗体可W是人的、人源化的或嵌合的。
[0194] 它也可W针对任何类型的抗原并且尤其针对上文描述的那些。特别地，当祀细胞 是癌细胞时，抗体可W针对癌细胞抗原，并且在治疗癌症情况下尤其针对上文描述的抗原 之一。当祀细胞是由病原体感染的细胞时，抗体可W针对感染细胞的抗原，并且在治疗感染 性疾病情况下尤其针对上文描述的抗原之一。当祀细胞是参与自身免疫疾病发展的免疫细 胞时，抗体可W针对运些免疫细胞的抗原，并且在治疗自身免疫疾病情况下尤其针对上文 描述的抗原之一。
[0195] 层析分级分离步骤（步骤a)优选地接续W下一个步骤（步骤b):合并获得的与层 析图主峰相对应的层析级分，因而获得的单克隆抗体组合物富含所述主峰，后者占步骤b) 中获得的组合物的层析图的至少85% (在分级分离和组合目的层析级分后）。
[0196]W下实施例对应于本发明的说明。 实施例
[0197] 实施例1.制备抗CD20抗体组合物的电荷同工型的纯化级分，表征同工型和其效 应子特性
[019引设备和方法
[0199] 抗CD20抗体组合物
[0200] 对克隆YB2/0产生的一批抗CD20抗体组合物全部分离和分析
[0201] 通过层析聚焦分离电荷同工型
[0202] 通过层析聚焦实施了相同抗体组合物的电荷同工型的S次制备性分离。
[020引使用阴离子交换树脂MonoP5/200GL。在每次分离时注入20mg脱盐的蛋白质。通 过使用W下两种缓冲液：缓冲液A:二乙醇胺25mM，缓冲液B:polybuffer96+pha;rmalyte 8-10. 5,通过递降抑梯度（pH9. 5至8.0)实施洗脱。
[0204] 分离的洗脱物W2mL级分收集。目的级分是第33至第50级分。
[0205] 浓缩3次分离的级分W分析。
[0206] 分离1 (SI)接受特定浓缩，从而该级分可W通过过滤除菌：
[0207]-在Amicon叫tralOkDa上浓缩该级分W获得1血体积 [020引-无菌过滤
[0209]-测量浓度的等分试样采样和测量活性的等分试样采样
[0210] 通过阳离子交换层析（CE讶分离电荷同工型
[0211] 通过阳离子交换层析，连同递增抑梯度（CE讶洗脱，实现对电荷同工型的11次分 离。
[021引 在30°C使用阳离子交换树脂SCX(M油化CSCX10. 4x250mm，Dionex)。通过使用 W下两种缓冲液：缓冲液A:20mM化H2P04,60mMNaCUpH6)，缓冲液B:20mM化HzPCVeOmM化Cl(pH10)，通过递增抑梯度（pH6至10)实现洗脱。
[0213] 按W下方式获得梯度：60分钟内10%至60%缓冲液B。
[0214] 分离的洗脱物W级分收集。目的级分是第1至第20级分。
[0215] 通过BIAC0RE分析与CD16受体的结合
[0216] 通过在BiacoreT100系统（GEHealthcare)上使用SPR("表面等离振子共振"） 技术开发了测量抗体组合物与受体CD16a结合的能力的方法。通过使用胺偶联法，将可溶 性受体CD16a固定在检测忍片上。流动小室用于抗体，其他流动小室保持空闲W扣除背景 噪声。将抗体种浓度注射并且通过W下方式估计动力学参数：对于每种浓度，产生结合 相的结合比例和解离相的结合比例。W共振单位（RU)表述的SPR信号表示抗体在受体处 的结合和解罔。
[0217] 借助CD16激活效应细胞（CD16化rkat试验）
[021引测试了通过层析聚焦和通过阳离子交换层析（CE讶分离的包含不同电荷同工型 的多种级分借助CD16受体（Fc丫RIII)诱导效应细胞反应的能力。
[0引引所用的试验如下：
[0220] 抗体与WIL2 -S细胞（阳性CD20祀细胞）和CD16化rkat细胞（效应细胞）（基 因型CD16F巧溫育。通过化ISA测量CD16化rkat细胞分泌的细胞因子（IL2)的量。
[0221] 更具体地，在96孔平板中混合：
[022引 ?抗体：50y1在IMDM5%FCS中范围从0. 156ng/ml至lOng/ml的稀释液 [022引?PMA:50y1 在IMDM5%FCS中 40ng/ml的稀释液（即化gPMA/50y1)
[0224].WIL2-S细胞：50y1 在IMDM5%FCS中 6xl〇5/ml(即 30x1〇3个细胞 /50y1) [022引.CD16 化rkat:50y1 在IMDM5%FCS中lOxl06/ml(即 500x103个细胞/50y1)
[0226] 使用两种对照：无任何祀细胞的阴性对照和具有最大活性的阳性对照：
[0227] 无任何祀细胞的阴性对照：每孔添加：
[022引.50y1 在按lOx106个细胞/ml(良P500x10 3个细胞 /50y1)的CD16Jurkat细 胞
[0229] ? 50y1 在 40ng/ml的PMA(即化gPMA/50y1)
[0230] ? 50y1最高浓度的抗体
[023" ? 50y1IMDM培养基巧 ％FCS
[0232]最大活性阳性对照：每孔添加：
[023引.50y1 按lOx106个细胞/ml(即 500x10 3个细胞 /50y1)的CD16 化rkat细胞
[0234] ? 50y1 40ng/ml的PMA(良P2ngPMA/50y1)
[023引 ? 50y1 5y邑/ml的离子霉素
[023引? 50y1IMDM培养基巧％SVF
[0237] 溫和揽拌并在37°C+/-0. 5°C溫育过夜
[023引 W 125g谨析细胞1分钟
[023引转移160y1上清液至96孔圆底平板中
[0240] 再次W 125g谨析细胞1分钟
[024。 在上清液中给予IL-2。在450皿读数。
[0242] 每份样品的CD16活性（IL- 2分泌）表述为参比样品的CD16活性的百分数。
[0243] 补体依赖性细胞毒性（CDC)
[0244] 祀细胞Wil2 -S在去补体的含10%FCS的IMDM培养基（培养基110)中培养。将 它们一周2次W0. 2X106个细胞/ml移植入F175瓶中的100ml培养基。从24至72小时 对移植的细胞进行试验，并再次WIX1〇6个细胞/ml在去补体的IMDM培养基巧％FCS(培 养基15)中吸收。
[0245] 人血清（通过全血凝固获得的人血清AB)在使用当日解冻。解冻在4°C实施。在 解冻后，血清在培养基15中稀释至1/2。
[024引 CdlT'i化r一Blue饭（Promega)胆存在-20°C，使用之前任由其在室溫解冻。
[0247] 待研究抗体的浓度在15培养基中调节至1yg/ml。
[024引在96孔U底平板中添加：
[024引? 50 "祀细胞（Wil2S，IX106个细胞 /ml)
[0250] ? 50y1待测试的抗体
[0巧1] ? 50y1稀释一倍的人血清。
[0巧2] 在调整至IX106个细胞/ml后，将细胞直接放置于平板中并置于37°C。
[0巧3] 将细胞溫育5分钟并且将样品在37°C揽拌，之后放置血清。
[0254] 产生两种对照：不含任何细胞（C-)的对照和具有抗体（AC-)的对照。遗漏的要 素用15培养基替代。
[0巧引将它们在37°c溫育2小时，同时揽拌。随后将30y1CdlTiter-Blue⑩加入到 每个孔，通过添加时反复抽吸混匀，并且溫育在37°C进行3小时和30分钟，伴W揽拌。
[0巧6] 在溫育结束时，通过添加25y1 3%SDS终止和稳定反应，可W将读数延迟到次 日。随后在室溫保存平板。
[0巧7] 在溫育结束时或次日，将平板W 125g离屯、2分钟。每孔采样100 y 1并且随后分 配于透明底部黑色光学平板中，同时保持平板水平。
[025引用巧光读数仪按W下参数实施平板的读出：
[0巧9] ?激发：530/25nm
[0260] ?发射：590/20nm
[0261] ?穿过平板底部读出（FOND)
[026引 ?积分时间：20yS
[0263] ?闪烁次数：25
[0264] ?增益：从不含任何抗体的对照孔（细胞+血清+15培养基）中取得的孔计算
[0265] ?W轨道模式进行强度2揽拌15秒。
[0266] 通过质谱法表征同工型
[0267] 通过如化evreux, - 2011中所述的质谱法，分析通过层析聚焦或通过阳离子交换 层析（CE讶分离的多种级分中存在的多种电荷同工型。
[026引运种方法包括利用细菌蛋白酶半脫氨酸（IdeS，降解酿脈链球菌（Streptococcus pyogenes)的免疫球蛋白的酶），所述酶在其交界结构域处特异性切割IgG，重链被切割成 两个分别由VH-CH1结构域和C肥-C册结构域组成的25kDa片段。运些片段由液相层析 法W乙腊梯度分离并且在质谱法中通过W下程序分析：
[0269] 将lOOyg通过层析聚焦或通过CEX纯化的级分冻干并重溶于消化 缓冲液（50mMNa&POz和150mM化C1，pH6. 30)中，并按照酶试剂盒（F油RICAT0R KitGenovis，Lund，瑞典）的说明添加100IUIdeS酶。将制备物在37°C溫育1小时，辅W 50W功率（CEMDiscoverSystem,CEM,Matthews,NC,美国）的微波W促进水解。接下来，添 加25y1变性缓冲液（8M脈和0. 4M畑4肥〇3，pH8, 0)，随后添加5y1 250mM的二硫苏糖醇 值TT)溶液。将样品在50°C溫育20分钟，辅W50W功的微波W确保彻底还原蛋白质，所述 蛋白质随后由液相层析-质谱（LC-M巧分析。
[0270] 将与20yg量相对应的反应混合物等分试样W350y1/分钟流速注射于平衡至 7〇°C的反相ProS地ereC4柱（150x2. Alltech)上。通过使用超高效液相层析 系统扣PLC，AcquityUPLC，Waters,Milford,M，美国），实施反相层析。通过使用0. 1%S氣乙酸灯FA)作为流动相A和包含0. 1 %TFA的乙腊作为流动相B生成梯度。W10%B等 梯度洗脱5分钟后，将B升高至27%持续5分钟并且随后升高至40%进一步持续10分钟。 随后将柱用90%的B洗涂3分钟并W10%的B再平衡2分钟，产生总持续时间25分钟。
[0271] 随后用质谱仪QSTAR(QSTARXLAppliedBiosystems，Toronto,加拿大）分析洗 脱的种类，所述质谱仪W500至3000m/z的正离子模式运行并根据制造商描述的程序对肾 素校准。
[0272] 结果
[0273] 通过层析聚焦分离电荷同工型
[0274] 图1中显示3次分离的层析图，所述层析图显示它们可W完美叠加，因此显示借助 层析聚焦的分离方法的重现性。因为使用了阴离子交换树脂和递降抑梯度，所W碱性同工 型首先洗脱，随后是主要同工型，并且接着是酸性同工型。
[0275] 收集级分33至50用于分析它们的生物化学特性和效应子特性。
[0276] 通过阳离子交换层析（CE讶分离电荷同工型
[0277] 图2中显示借助电荷同工型的阳离子交换层析（CE讶的11次分离的层析图。因 为使用了阳离子交换树脂，所W酸性同工型首先洗脱，随后是主要同工型，并且接着是碱性 同工型。
[0278] 在CEX中再分析峰4 (P4,主峰）W检验纯化的效率。图3和下表4中显示用CEX 分离之前和之后获得的酸性同工型、主要同工型和碱性同工型的百分数，并且运些百分数 清楚地显示纯化主峰的效率。
[0279]表格4.用CEX分离之前和之后酸性同工型、主要同工型和碱性同工型的百分数
[0280]
阳2引]通过BIACORE分析与CD16受体的结合
[0282] 测试了通过阳离子交换层析分离的包含不同电荷同工型的各种级分与受体CD16 结合的能力。
[0283] 结果在图4中显示，并且显示对酸性形式（P1至P3)和对峰7 (P7)的亲和力丧失， 但是对其他碱性形式（P6、P8)的亲和力未丧失。
[0284] 借助CD16激活效应细胞仰16化rkat试验）
[0285] 测试了通过层析聚焦和通过阳离子交换层析（CE讶分离的包含不同电荷同工型 的多种级分借助CD16受体（Fc丫RIII)诱导效应细胞的反应的能力。
[0286] 在5图脚X)和下表5 (通过层析聚焦分离）中显示结果。
[0287] 在每种情况下，观察到与主要同工型相对应的级分诱导CD16化rkat细胞活化，运 比包含酸性同工型或碱性同工型的显著更明显。
[028引因此，多种电荷同工型借助CD16活化效应细胞的能力大幅度变动，与活化表达CD16的效应细胞的其他同工型相比，主要同工型具有显著改善的能力。
[0289] 显示在抗体组合物存在下测量受体CD16转染的化rkat细胞分泌的IL- 2的 量的上述试验代表了运种抗体组合物通过表达CD16的效应细胞诱导ADCC的能力（W0 2004/024768)。因此，下表4至表6中所示的结果显示，与其他同工型相比并且与包含全部 同工型的总组合物相比，与纯化前层析聚焦或CEX的主峰相对应的纯化级分具有显著改善 的借助表达CD16的效应细胞诱导ADCC的能力。
[0290] 表5.参比组合物、分离前总组合物和来自层析聚焦分离的级分F36(碱性同工 型）、F39 (主要同工型）和F43、F44、F48,F49和巧0 (递增的酸性同工型）的CD16化rkat 细胞活化作用。
[0291]
[0292]
[0293] 补体依赖性细胞毒性（CDC)
[0294] 测量了通过阳离子交换层析（CE讶分离的包含不同电荷同工型的多种级分诱导 补体依赖性细胞毒反应（CDC)的能力。
[029引结果在6图中显示，并且显示与主峰（P4)相比，对酸性形式（P1 :37%，P2 :52%， 并且P3 :69% )和碱性形式（P5 :45%，P6 =K1 :64%，P7 :35%，并且P8 =K2 :49% )的活 性的剧烈丧失。与主要同工型（P4)相对应的峰因此诱导比包含酸性同工型或碱性同工型 的级分显著更大的CDC反应。
[0296] 通过质谱法表征同工型
[0297] 通过层析聚焦纯化的级分和通过CEX纯化的级分由LC-MS分析W表征含有或不 含N末端赖氨酸的重链的百分数。
[029引对于与分离前主峰相对应的通过层析聚焦纯化的级分和通过CEX纯化的级分，该 分析显示超过95 %的重链不包含任何C末端赖氨酸。
[0299] 结论
[0300] 上文所示的结果显示，与相同抗体组合物的酸性或碱性同工型相比，与通过离子 交换层析（CE讶或通过层析聚焦分离的主峰相对应的抗体组合物的电荷同工型具有显著 更大的借助受体Fc丫RIII(CD16)W及还借助补体活化效应细胞的能力。
[0301] 使用与运种主峰