Western blot 结果。
[0043] 图6为刺甘草查尔酮降低MEFs细胞中H202诱导的细胞老化指标SA- β -gal升高 的实验结果。其中图6(A)为SA-β -gal染色结果，图6(B)为SA-β -gal染色定量结果。
[0044] 图7为刺甘草查尔酮对于Nrf2敲除MEFs细胞中Nrf2信号及下游基因影响的实 验结果。其中图7(A)、图7(B)为qPCR结果，图7(C)为Western blot结果。
[0045] 图8为刺甘草查尔酮不能降低Nrf2敲除MEFs细胞中H202诱导的细胞老化指标 SA- β -gal升高的实验结果，其中图8㈧为SA- β -gal染色结果，图8 (B)为SA- β -gal染 色定量结果。
[0046] 图9为刺甘草查尔酮升高MEFs细胞中H202诱导的GSH降低的实验结果，其中图 9 (A)为野生型MEF中GSH结果，图9 (B)为Nrf2敲除MEFs中的结果。
[0047] 图10为刺甘草查尔酮在激活MEFs细胞中AMPK信号通路，其中图10 (A)、图10 (B) 为浓度时间依赖激活AMPK下游的Western blot结果，图10 (C)为预处理Compound C后， AMPK 及 Nrf2 下游 Western blot 结果。
[0048] 图11为刺甘草查尔酮延长线虫寿命的实验结果，其中图11(A)为线虫寿命结果， 图11(B)为给予过氧化氢后，线虫寿命结果。
[0049] 图12为刺甘草查尔酮激活JB6P+细胞中Nrf2信号及下游基因的实验结果，其中 (A)为qPCR结果，⑶为Western blot结果。
[0050] 图13为刺甘草查尔酮抑制JB6P+细胞中TPA诱导的恶性转化。其中A为空载体 细胞（mock)中结果，B为Nrf2敲除细胞中结果。
[0051] 图14为刺甘草查尔酮激活小鼠肝脏组织中Nrf2信号的实验结果。其中（A)为 qPCR 结果，（B)为 Western blot 结果。
[0052] 图15为刺甘草查尔酮降低肝损伤小鼠血清ALT和AST水平的实验结果。
[0053] 图16为刺甘草查尔酮增加肝损伤小鼠肝脏组织中GSH水平的实验结果。
[0054] 图17为肝组织病理切片结果。
【具体实施方式】
[0055] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0056] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0057] 实施例1、刺甘草查尔酮对Nrf2的激活作用
[0058] 本实施例中考察了刺甘草查尔酮对Η印G2细胞活力及Nrf2/ARE报告基因活性的 影响。
[0059] 一、实验材料和方法
[0060] (1)刺甘草查尔酮购自成都曼思特生物科技有限公司，其核磁共振氢谱和核磁共 振碳谱如图1和图2所示。人肝癌细胞株HepG2购自美国菌种保藏中心（ATCC)，实验均采 用处于对数生长期的细胞。
[0061] HepG2 细胞米用 Lipofectamine 2000 (Life Technologies 公司）稳定转染 Nrf2 萤光素酶报告基因，得到的细胞称之为ifepG2C8细胞。将Η印G2C8细胞接种于24孔板12 小时后，分别加入指定浓度的刺甘草查尔酮，6小时后裂解细胞，检测萤光素酶活性，并根据 不同组的蛋白浓度对活性进行校正。
[0062] (2) !fepG2细胞接种于96孔板12小时后，分别加入指定浓度的刺甘草查尔酮，继续 培养24小时，向每孔加入MTS溶液（美国Promega公司）至终浓度为0. 5mg/mL，继续培养 2~4个小时，用自动酶标仪于490nm测定各孔吸光度，分析其抑制率。
[0063] 二、实验结果
[0064] (l)Nrf2是调节体内氧化还原平衡的重要转录因子，其通过抗氧化响应元件 (ARE)控制着细胞II相药物代谢酶和抗氧化基因的表达，激活Nrf2信号通路可以减轻各种 因素引起的细胞氧化损伤。本实施例采用Nrf2萤光素酶报告基因的方法，测定刺甘草查尔 酮的Nrf2激活作用。如图3所示，刺甘草查尔酮可以剂量依赖地激活Nrf2报告基因活性， 在20 μ Μ时的活性最强，达到6. 8倍。
[0065] (2)刺甘草查尔酮对Η印G2细胞有较弱的细胞毒性，如图4所示，仅在40 μ Μ时对 !fepG2细胞活力产生17%的抑制率。
[0066] 实施例2、刺甘草查尔酮在制备激活Nrf2和/或AMPK信号通路中的产品、抗氧化 酶诱导剂及抗衰老产品中的应用
[0067] 一、实验材料和方法
[0068] (l)MEFs细胞取自怀孕13. 5天的C57小鼠胚胎（陈明玉，实验动物科学）。取对 数生长期的MEFs细胞接种于6孔板24小时后，分别加入指定浓度的刺甘草查尔酮，继续培 养6小时或指定时间。弃去上清，细胞用TRIZ0L缓冲液（北京全式金生物技术有限公司） 裂解以提取总RNA。然后采用qPCR方法检测H0-1和NQ0-1的mRNA水平。
[0069] (2)MEFs细胞接种于60mm皿24小时后，分别加入指定浓度的刺甘草查尔酮，继续 培养6小时或指定时间。弃去上清，细胞用RIPA缓冲液（上海碧云天生物技术有限公司）裂 解，BCA法测定蛋白浓度。每个样品取20 μ g蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE) 分离，然后按常规免疫印迹方法检测Nrf2, H0-1，p-AMPK，p-ACC和NQ0-1的蛋白水平。
[0070] (3) MEFs细胞接种于6孔板24小时后，给予10 μ Μ的刺甘草查尔酮，继续培养6小 时后，给予100 μΜ的Η202处理两小时，换为完全培养基继续培养72小时后，用3%的甲醛 固定5分钟后，用β-gal溶液（上海杰美基因医药科技有限公司）染色。染色16小时后， 在倒置显微镜下拍照，并用Image-Pro Plus软件统计。
[0071] (4) MEFs细胞接种于60mm皿后，给予10 μ Μ的刺甘草查尔酮，继续培养24小时后， 给予100 μ Μ的Η202处理两小时。将细胞用80 μ 1裂解液裂解，取上清用DNTB法测定GSH 的含量。
[0072] (5)线虫寿命实验。本实验所用的秀丽隐杆线虫，购自于CGC。将刺甘草查尔酮配 置成lOmmol的DMS0母液，5_Fu配置成50mmol、25mmol两种浓度的DMS0母液，均置于4°C冰 箱保存。实验采用液体培养，在24孔培养皿加入500 μ L的0P50菌悬液（S缓冲液+0P50)， 给药组加入〇. 5 μ L药液和0. 5 μ L50mmol的5_Fu，空白组加1 μ L 15mmol的5_Fu。同期化 处理线虫，将L4期线虫用M9洗下，于解剖镜下转移至液体培养液中，每组平行操作3份，每 份30条。转移当天记为day 0,每天探视线虫，并转移至新的培养液中，记录线虫生存、死亡 条数。培养温度20°C。对线虫死亡判断标准：无移动及吞咽动作，轻触后仍无任何反应。
[0073] (6)同期化处理线虫，将L4期线虫于解剖镜下转移至液体培养液中，每组平行操 作3份，每份30条。给予10 μ Μ的刺甘草查尔酮处理48小时后，给予3mM H202处理。
[0074] 每隔2小时探视线虫，并转移至新的培养液中，记录线虫生存、死亡条数。培养温 度20°C。对线虫死亡判断标准：无移动及吞咽动作，轻触后仍无任何反应。
[0075] 二、实验结果
[0076] (1)刺甘草查尔酮对于Nrf2信号通路的影响。如图5所示，刺甘草查尔酮能剂量 和时间依赖地增加 MEFs细胞中Nrf2蛋白水平，以及Nrf2下游抗氧化酶H0-1和NQ0-1的 mRNA水平和蛋白水平。
[0077] (2)如图6所示，在MEFs中先给予刺甘草查尔酮能显著降低H202诱导SA-β -gal 染色升高。
[0078] (3)如图7所示，在Nrf2 / -MEFs中刺甘草查尔酮不能时间依赖地增加 MEFs细胞 中Nrf2蛋白水平，以及Nrf2下游抗氧化酶H0-1和NQ0-1的mRNA水平或蛋白水平。
[0079] (4)如图8所示，在Nrf2 / -MEFs中先给予刺甘草查尔酮不能显著降低H202诱导 SA-i3-gal染色升高。
[0080] (5)如图9所示，在野生型MEFs中刺甘草查尔酮能显著升高由H202诱导的GSH降 低，但在Nrf2 / -MEFs中，这种保护作用消失。
[0081] (6)如图10所示，刺甘草查尔酮能剂量和时间依赖地升高p-AMPK及下游p-ACC 的蛋白水平，并且使用AMPK的抑制剂Compound C后，刺甘草查尔酮对于p-AMPK，p-ACC及 Nrf2和H01蛋白水平的升高均有所降低。
[0082] (7)如图11所示，刺甘草查尔酮处理后能显著延长N2型线虫的寿命，并能在H20 2存在下保护线虫，延长生存时间。以上保护作用，在skn-l(zul35)和aak2(ok524)突变的 线虫上是缺失的。
[0083] 以上实验结果说明，刺甘